VYŠETROVANIE PDF O METABOLIZMU GLUKÓZY - PDF na stiahnutie zadarmo
Stručný opis
1 55 VYŠETROVANIA METABOLIZMU GLUKÓZY A. BIOCHEMICKÉ ZÁSADY U zdravých ľudí je hladina glukózy v krvi.
Popis
VYŠETRENIA GLUKÓZOVÉHO METABOLIZMU A.
Chronické ochorenia pečene sa vyskytujú alebo sú spôsobené prevahou kontrakulárnych hormónov (napr. Pri akromegálii, Cushingovej chorobe, feochromocytóme). Primárne formy cukrovky sa delia na dve hlavné skupiny, a to cukrovku typu I, takzvanú juvenilnú cukrovku, ktorej príčinou sa dnes považujú imunologické faktory, ktoré vedú k deštrukcii B buniek, a tým k deficitu inzulínu, na druhej strane II Cukrovka (cukrovka pre dospelých), pre ktorú sú rozhodujúce ďalšie, čiastočne zatiaľ neznáme mechanizmy. Spravidla to nemá za následok nedostatok inzulínu, ale skôr znížený inzulínový účinok, napríklad z dôvodu nedostatku inzulínových receptorov. Najmä pri cukrovke typu II, ktorá môže postupovať pomaly po dlhšiu dobu, a tak zostať nezistená, je možné zabrániť progresii ochorenia, ak sa liečia rizikové faktory obezita, poruchy metabolizmu lipidov, fyzická nečinnosť a prevaha antiinzulínových hormónov. Dôležitú úlohu pri detekcii zohráva test glukózovej tolerancie vykonaný na stáži.
Pri cukrovke typu I budú mať v budúcnosti dôležitejšiu úlohu imunologické skríningové testy (na protilátky proti častiam buniek ostrovčekov), ktoré sa objavia dlho pred nástupom ochorenia, ktoré je pre pacienta obvykle náhle. V tomto okamihu je však zvyčajne už 80% buniek ostrovčekov zničených. Je
Udržiavanie konštantnej hladiny glukózy v krvi prísnou metabolickou kontrolou (inzulín, strava, cvičenie) s cieľom oddialiť sekundárne ochorenia, ako je artérioskleróza, slepota, poškodenie obličiek, gangréna a neuropatie. Dôležitou pomôckou je stanovenie glykozylovaného hemoglobínu uskutočnené na stáži. Pacienti trpiaci nekontrolovaným cukrovkou majú často vysoké koncentrácie glukózy v plazme. To vedie k zvýšeným koncentráciám glykovaného hemoglobínu v erytrocytoch. Erytrocyty od zdravých osôb s normálnou hladinou glukózy v krvi obsahujú 4 - 7% ich celkového hemoglobínu v glykozylovanej forme. U zle alebo zle kontrolovaných diabetikov môže táto hodnota dosiahnuť 18 - 20%. Stanovenie glykozylovaného hemoglobínu umožňuje dlhodobé sledovanie hladiny glukózy v krvi. Po úprave zostáva hemoglobín v krvi, pokiaľ je erytrocyt nažive (približne 120 dní). Zvýšená hladina glykovaného hemoglobínu začne klesať až po 5 - 6 týždňoch po úprave hladiny glukózy a do normálneho rozsahu sa dostane po približne 20 týždňoch.
Označuje koncentráciu glukózy v krvi, koncentrácia glykovaného hemoglobínu predstavuje akýsi integrálny prostriedok nad hladinu glukózy v krvi po dobu niekoľkých týždňov.
Test glukózovej tolerancie V teste glukózovej tolerancie sa hladina glukózy v krvi meria 1,5 hodiny po perorálnej expozícii glukóze a jej priebeh sa porovnáva s priebehom v priebehu času so štandardným kolektívom. Okrem tohto nepriameho testu funkčnosti B buniek Langerhansových ostrovčekov je možné priamo pomocou zložitých imunologických techník tiež priamo určiť časový priebeh koncentrácie inzulínu v sére. Zvýšenie a zníženie koncentrácie glukózy v krvi pozorované pri teste glukózovej tolerancie u zdravých jedincov (normálny kolektív) alebo u diabetikov je uvedené v tabuľke I. Existuje podozrenie na asymptomatický diabetes mellitus, ak je prekročená maximálna hodnota 11,1 mmol/l očakávaná po 30 - 60 minútach. Hodnota 2 hodiny je diagnosticky hodnotnejšia; ak je nad 7,8 mmol/l, ide o diabetes mellitus. Naopak, maximálne hodnoty pod 8,9 mmol/l a dvojhodinové hodnoty pod
6,7 mmol/l normálny rozsah. Hodnoty v strednom rozmedzí sú podozrivé a je potrebné ich skontrolovať. Aby nedošlo k ohrozeniu pacienta s pravdepodobnosťou cukrovky provokačným testom, je vopred vylúčená manifestná cukrovka pomocou „denného profilu glukózy v krvi“.
Vyhodnotenie orálnej expozície glukózy v krvi po podaní glukózy Koncentrácia glukózy v krvi v kapilárnej krvi v mmol/l 0 '
Test glukózovej tolerancie možno tiež použiť na detekciu (a spustenie) patologickej hypoglykémie z rôznych príčin (funkčný hyperinzulinizmus; adenóm ostrovčekových buniek), pri ktorej maximálne hodnoty po perorálnom podaní glukózy zostávajú pod normálnymi hodnotami. Primárny diabetes mellitus možno rozdeliť do štyroch etáp: 1.
Potenciálny diabetes: žiadny diabetický metabolizmus, diabetické skríningové testy normálne, ale rodinná záťaž; asi 25% našej populácie
Latentný diabetes: pri strese, tehotenstve alebo nadváhe môže byť pozitívny aj test glukózovej tolerancie.
Asymptomatický („subklinický“ alebo „chemický“) diabetes: test glukózovej tolerancie pozitívny; asi 8% populácie.
Klinický diabetes: manifestný diabetes; asi 3% populácie. Hyperglykémia a prípadne glukozúria. Skríningové testy na cukrovku sa nevyžadujú. V takom prípade môžu testy pacienta ohroziť!
Glykovaný hemoglobín Glykovaný hemoglobín sa produkuje neenzymatickou adíciou glukózy na aminoskupiny lyzínu v peptidovom reťazci alebo na N-terminálny koniec a podjednotky. Transportér glukózy v membráne erytrocytov zaisťuje rýchlu výmenu glukózy, takže v erytrocytoch je rovnaká koncentrácia glukózy ako v plazme. Aldosy reagujú s voľnými aminoskupinami za vzniku Schiffovej bázy. Amadoriho prešmykom je glykozylový zvyšok nevratne kovalentne fixovaný v druhom kroku (obr. 1).
Špecifické stanovenie glykovaného hemoglobínu (HbA1) v hemolyzáte je možné po predchádzajúcej separácii hemoglobínových frakcií pomocou iónomeničovej chromatografie. Tento separačný proces je založený na elektrostatickej interakcii iónov vo vzorke, ktorá sa má skúmať, s iónomeničom, ktorý obsahuje skupiny s opačným nábojom, ktoré sú kovalentne fixované na nerozpustný nosič (matricu). Protiióny interagujúce s iónomeničom je možné vymeniť za iné ióny s rovnakým nábojom. V závislosti od náboja iónomeniča, iónomeniče),
Iónové výmenníky) so záporným nábojom. Rovnako ako takmer všetky bielkoviny, aj hemoglobín nesie vo vodnom roztoku elektrický náboj, ktorý je spôsobený kyslými alebo zásaditými skupinami bočných reťazcov aminokyselín, ako aj terminálnymi amino a -karboxylovými skupinami. Čistý náboj molekuly je výsledkom súčtu pozitívnych a negatívnych jednotlivých nábojov a závisí od hodnoty pH proteínového roztoku. PH, pri ktorom je počet pozitívnych nábojov z
negatívny a pri ktorom sa molekula javí navonok bez náboja, sa nazýva izoelektrický bod. Pod izoelektrickým bodom (IP) je náboj molekuly kladný (katión), a preto sa môže viazať na katiónový výmenník, zatiaľ čo nad IP je čistý negatívny náboj (anión), ktorý umožňuje proteínu viazať sa na aniónový výmenník. Elektrostatický efekt medzi proteínom a iónomeničom sa môže oslabiť alebo dokonca úplne rozpustiť zmenou hodnoty pH alebo zvýšením koncentrácie solí (kompetitívne ióny). V tomto experimente sa na oddelenie rôznych čiastkových frakcií hemoglobínu používa slabo kyslý katiónový výmenník. Podiel hemoglobínu sa zmieša so suspenziou iónovej výmeny. Za zvolených podmienok (pH = 7,0) sa viaže iba normálny hemoglobín, zatiaľ čo glykozylovaný hemoglobín (HbA1) zostáva v supernatante. Rozdielne adsorpčné správanie týchto dvoch látok
glykozylovaný a normálny hemoglobín, ktorý vzniká ireverzibilnou väzbou glukózy na aminoskupinu proteínu, pri nezmenenom pH, posúva jeho celkový náboj smerom k negatívnemu rozsahu a tým znižuje väzbové sily medzi glykozylovaným hemoglobínom a iónomeničom.
Všeobecné otázky metabolizmu glukózy; Regulácia hladiny glukózy v krvi; Účinok inzulínu a jeho antagonistov; Chémia uvedených hormónov; Metabolické zmeny pri diabetes mellitus; Hemoglobín (štruktúra, funkcia, krivka väzby kyslíka, Bohrov efekt, tlmivý účinok, patologické zmeny: kvantitatívne a kvalitatívne hemoglobinopatie, kosáčikový hemoglobín); Myoglobín.
CIEĽ EXPERIMENTOV
Test tolerancie na glukózu Potom, čo testovaná osoba odobrala definované množstvo glukózy orálne, koncentrácia glukózy v krvi rýchlo stúpa po resorpcii glukózy z lúmenu čreva. Koncentrácia glukózy v krvi sa opäť normalizuje do určitého času po začiatku cvičenia. Po tomto procese by malo nasledovať stanovenie koncentrácie glukózy v kapilárnej krvi. Pozorované zvýšenie a zníženie koncentrácie glukózy v krvi by malo byť zobrazené graficky a potom interpretované.
Glykovaný hemoglobín
komerčne dostupná súprava reagencií obsahujúca suspenziu slabo kyslého katexu pripravenú na priame použitie. Cieľom je zistiť množstvo glykozylovaného hemoglobínu vo vlastnej krvi, ako aj vo vzorke so zvýšenou hodnotou (diabetická krv).
POSTUP SKÚŠKY A SKÚŠOBNÝ PROTOKOL
Priniesť zoznam: smock, kalkulačka
Pripravte si päť Eppendorfových skúmaviek, každá s 0,5 ml kyseliny chloristej (0,35 mol/l). Po 30, 60 a 90 minútach sa pomocou špičkovej špičky prsta pomocou kapilárnej pipety odstráni 0,05 ml kapilárnej krvi a kapilára sa vloží do skúmaviek Eppendorf s kyselinou chloristou a dobre sa pretrepe (deproteinizácia!). Po odobratí 0,05 ml kapilárnej krvi na stanovenie hodnoty glukózy v krvi nalačno (vzorka 1) vypije testovaná osoba roztok 75 g glukózy v 300 ml džúsu. Čas je zaznamenaný. 10 minút po odobraní poslednej vzorky a deproteinizácii kyselinou chloristou sa centrifuguje 4 minúty pri maximálnej rýchlosti. Supernatanty sa opatrne dekantujú, prevedú do nových skúmaviek Eppendorf a znovu centrifugujú 4 minúty. Supernatanty sa používajú na stanovenie glukózy v krvi (oddiel C.3.). Označte nádoby číslom skupiny a číslom vzorky a zvyšné vzorky po ukončení testu odovzdajte asistentovi.!
Glukózové činidlo: Glukózooxidáza (GOD) oxiduje glukózu na kyselinu glukónovú za tvorby H2O2. Peroxid vodíka oxiduje donor vodíka (fenol a 4-aminofenazón) na farbivo D v reakcii katalyzovanej peroxidázou (POD):
BOH glukóza + H2O + O2 kyselina glukónová + H2O2
Množstvo vytvoreného farbiva D je mierou množstva prevedeného glukózy. Pretože molárny extinkčný koeficient D závisí od podmienok testu, nameraná extinkcia (vlnová dĺžka 500 nm) súvisí s extinkciou štandardnej hodnoty glukózy.
Stanovenie glukózy v krvi
Potrebné riešenia sú na pracovnom stole: I:
Fosfátový pufor s glukózovým činidlom, 0,10 mol/l, pH = 7,0; 50 ug chromogénu (0,75 mmol/l fenolu a 0,25 mmol/l 4-aminofenazónu); > 1,5 KU/l POD; > 15 KU/l BOH; > 2,0 KU/l mutarotázy
Glukózový štandard (5,55 mmol/l).
50 μl hladiny glukózy sa zriedi v 0,5 ml kyseliny chloristej. Pomocou pripravených vzoriek (časť C.1.) Pripravte dávky podľa nasledujúcej tabuľky, dôkladne ich premiešajte a nechajte stáť 10 minút pri izbovej teplote.
Kalibrujte fotometer pri 500 nm, stanovte absorbanciu štandardu a vzoriek oproti slepej hodnote.
Glykovaný hemoglobín 1.
Odoberanie krvi a príprava hemolyzátu: 200 ul hemolýzneho činidla sa umiestni do nádoby Eppendorf (Eppi) označenej písmenom „E“; Odoberte krv pomocou 50 ul kapilárnej pipety; Okamžite pridajte naplnenú kapiláru do Eppi a dobre premiešajte, aby sa krv vypláchla; Necháme 5 minút postáť.
Prístup HbA1 Prístupy sa pripravujú paralelne s hemolyzátmi zo štandardnej krvi (Eppi „S“), autológnej krvi (Eppi „E“) a diabetickej krvi (Eppi „D“). Pred pipetovaním hemolyzát poriadne pretrepte! Pipetujte 100 ul hemolyzátu do každej z iónomeničových skúmaviek; Označte skúmavky („S“, „E“ alebo „D“) a vložte oddeľovače (ponechajte asi 1 cm nad kvapalinou); Inkubujte 5 minút a intenzívne pretrepávajte v intervaloch jednej minúty; Opatrne vytlačte kvapalinu zo separátora a zmerajte absorbanciu [Bod 4 (E1)].
Celková dávka Hb V troch paralelných dávkach sa 20 μl hemolyzátu „S“, „E“ alebo „D“ vloží do skúmavky s 5 ml destilovanej vody. zmiešané. (Nezabudnite na nápis)! Nechajte stáť 5 minút a potom zmerajte absorbanciu [Bod 4 (EG)]
Meranie extinkcie vzoriek krvi pri = 405 nm (fotometer je nastavený proti vode).
Test tolerancie na glukózu (vykonanie experimentu) Zhrnutie Vykonajte položky 1-4 okamžite, potom čítajte ďalej ! Experiment 1 1) 2) 3) 4)
Do 500 ml Eppisu (označené 0,30, 60,90 min.) Pridajte 500 ul kyseliny chloristej a odoberte krv. Použite na to kapiláru. (Kapilára musí byť plná, žiadna vzduchová bublina) Kapiláru vhoďte do nádoby označenej „0 min“ a ihneď dobre pretrepte. Pite kolu, zapíšte si čas.
Experiment 2: Môže sa uskutočniť kedykoľvek (je vhodný čas 30 alebo 60 minút od experimentu 1).
Časť B) 21) Naplňte tri skúmavky, každá do 5 ml vody (označené „E“, „S“, „D“) 22) Z Eppisu („E“, „S“, „D“) po 20 μl hemolyzátu skúmavky naplnené vodou
dať. 23) Dobre premiešajte a nechajte stáť 5 minút. 24) Zmerajte absorbanciu znova proti vode pri 405 nm.
Po vyčistení nevyhadzujte skúmavky s glukózovým štandardom, glukózovým reagentom a hemolytickým reagentom. Všetky ostatné nádoby so vzorkou sa zlikvidujú v určených nádobách na odpad z krvi.
HODNOTENIE A CHYBOVÁ DISKUSIA
Test glukózovej tolerancie Do nasledujúcej tabuľky zadajte nameranú absorbanciu a výsledky stanovenia glukózy a zakreslite krivku. Ako interpretujete výsledky?
E500 koncentrácia glukózy v krvi (mmol/l)
Koncentrácia glukózy v krvi sa počíta takto:
Glykolizovaný hemoglobín Zmerajte absorbanciu v nasledujúcej tabuľke, stanovte faktor F a vypočítajte percento frakcie HbA1 v celkovom hemoglobíne autológnej a diabetickej krvi. Podiel HbA1 v štandardnej krvi je 6,8%.