VÝZNAM NLRC5 ODSTRÁNIŤ MYŠ V RÔZNYCH MODELOCH ZÁPALU V KONBATE

Klinika vnútorného lekárstva I (riaditeľ: prof. Dr. Stefan Schreiber) na University Medical Center Schleswig-Holstein, Campus Kiel na Univerzite Christiana Albrechts v Kieli DÔLEŽITOSŤ KNOCK OUT MYŠI V RÔZNYCH MODULOCH ZÁPALU PRÍSLUŠNÉHO IMUNITNÉHO SYSTÉMU Úvodná dizertačná práca s cieľom získať doktora Fakulta Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, ktorú predstavila NICOLINA LARA BÖTTCHER z Kiel Kiel 2012

modeloch

1. Spravodajca: prof. Dr. Rosenstiel 2. reportér: Prof. Dr. Grassl Deň ústnej skúšky: 18. decembra 2013 Schválené pre tlač, Kiel, 13. novembra 2013 podpísané Prof. Dr. Chváli

Týmto vyhlasujem, že dizertačná práca na tému Význam myši Nlrc5 Knock-Out v rôznych modeloch zápalu vrodeného imunitného systému je okrem rád môjho doktorského školiteľa a mojich ďalších akademických pedagógov po formálnej i obsahovej stránke mojou vlastnou prácou a že okrem Nepoužíval som žiadne ďalšie pomôcky uvedené v zozname Všetky doslovné alebo obsahové pasáže som označil ako také. Tiež potvrdzujem, že som predložil iba priloženú dizertačnú prácu v tomto a žiadnom inom doktorandskom konaní a že tomuto doktorandskému konaniu nepredchádzali žiadne nakoniec neúspešné doktorské postupy. Miesto, dátum, podpis

i Obsah Zoznam skratiek a výrazov technici. iii Zoznam obrázkov. v Zoznam tabuliek. v 1 úvod. 1 1.1 Zápalové ochorenie čriev. 1 1.2 Genetické asociačné štúdie v oblasti chronických zápalových chorôb. 3 1.3 Autozápalové choroby. 4 1.4 Vrodený imunitný systém a receptor rozpoznávania vzorov. 5 1.4.1 Génové asociácie rodiny receptorov podobných Nod s chronickými zápalovými ochoreniami. 7 1.4.2 Rodina receptorov podobných Nod. 8 1.5 Vydanie. 11 2 Materiál a metódy. 13 2.1 Materiál. 13 2.2 Myši. 13 2.3 Pokusy na myšiach. 14 2.3.1 Príprava myší. 14 2.3.2 Endotoxínový šok. 14 2.3.3 Kolitída vyvolaná DSS. 15 2.4 Izolácia myšieho tkaniva/buniek. 17 2.4.1 Izolácia DNA z myších chvostov. 17 2.4.2 Makrofágy odvodené od kostnej drene (BMDM). 17 2.4.3 Pľúca. 19 2.4.4 Stimulácia. 19 2.5 Molekulárne biologické metódy. 2.5.1 Izolácia RNA z tkaniva. 20 2.5.2 syntéza cdna. 21 2.5.3 Reverzná transkriptázová polymerázová reťazová reakcia (RT-PCR). 21 2.5.4 Elektroforéza na agarózovom géle. 2.5.5 Real-Time PCR. 2.5.6 ELISA. 23 2.6 Histologické metódy. 24 2.6.1 Príprava. 24 2.6.2 HE farbenie. 24 2.7 Štatistika. 25 3 výsledkov. 26

ii 3.1 Nlrc5. 26 3.1.1 Genomická organizácia myší Murc Nlrc5. 26 3.1.2 Expresný profil Nlrc5. 27 3.1.3 Regulácia Nlrc5 interferónom-y. 27 3.2 Potvrdenie vypadnutia. 28 3.3 Bazálna fenotypizácia myši s deletovaným Nlrc5. 29 3.3.1 Bazálna histológia črevných orgánov. 29 3.3.2 Bazálne laboratórne hodnoty. 32 3.4 Provokačné modely. 33 3.4.1 Endotoxínový šok. 33 3.4.2 Stimulácie pomocou LPS in vitro. 35 3.4.3 Kolitída vyvolaná dextránsulfátom sodným (DSS). 36 4 Diskusia. 42 4.1 Myš s odstráneným Nlrc5. 42 4.2 Expresia a indukcia myšieho Nlrc5. 4.3 Delécia Nlrc5 chráni v modeli akútneho zápalu. 44 4.4 Zhoršený zápal myši s deletovaným Nlrc5 pri kolitíde vyvolanej DSS. 47 4.5 Dichotomický účinok Nlrc5 v rôznych modeloch zápalu. 49 4.6 Výhľad. 53 5 Zhrnutie. 55 Bibliografia. 56 Príloha Použité materiály. 61 Poďakovanie. 63 životopis. 64

iv RIG RLR RNA Rpm RPMI-1640 RT-PCR sirna SD SEM Tab. TAE Taq TH TLR TMB TNF Tube Well WT Indukovateľný gén pre kyselinu retinovú Gén indukovateľný pre kyselinu retinovú (RIG) ako receptor Ribonukleová kyselina Počet za minútu Roswell Park Memorial Institute, špecifické bunkové kultivačné médium Reverzná transkriptázová-polymerázová reťazová reakcia Malá interferujúca ribonukleová kyselina Štandardná odchýlka Štandardná chyba priemeru Tabuľka Tris-Acetát-EDTA Termofilus aquaticus T-pomocná bunka Toll-like receptor Tetrametylbenzidín Faktor nekrózy nádoru Plastická reakčná nádoba Dobre v reakčnej doske Divoký typ myši alebo myši Ako sú bežné u Anglické výrazy v tejto práci uvedené kurzívou. Pre presnejšiu diferenciáciu sú gény na rozdiel od proteínov písané aj kurzívou. Pre myšacie zložky sa používajú malé písmená a pre ľudské veľké písmená. V tejto práci sa väčšinou používa súčasná nomenklatúra Výboru pre génovú nomenklatúru organizácie pre ľudský genóm z roku 2008. Výnimkou je termín Nod-like receptor, ktorý sa kvôli svojej popularite používa pre nukleotidovú väzbovú doménu a rodinu obsahujúcu repetície bohatú na leucíny.

Úvod 12 sa uskutočnil test endotoxínového šoku, pri ktorom hrá hlavnú úlohu interleukín-1. Na druhej strane bol použitý komplexný model experimentálnej kolitídy, ktorý zahŕňa akútnu fázu s mechanizmami hojenia rán aj chronickú fázu so stimuláciou adaptívnej imunitnej odpovede. V tejto práci boli skúmané nasledujúce otázky: Je možné akútnu alebo chronickú zápalovú reakciu upraviť in vivo genetickým nedostatkom Nlrc5? Ako ovplyvňuje delécia Nlrc5 cytokínovú odpoveď pri akútnej a chronickej zápalovej reakcii? Ako ovplyvňuje štrukturálna podobnosť Nlrc5 s ostatnými Nod-podobnými receptormi, ktoré sú známe svojou asociáciou s určitými chorobami, jeho úlohu v vrodenom imunitnom systéme?

Materiál a metódy 25 sekúnd 70%, 80% a 90% izopropanolu, potom 2 x 5 minút 100% izopropanol). Potom nasledovali 3 minúty hylolu ako organického rozpúšťadla a prikrytie do eukittu krycím sklíčkom. 2.7 Štatistika Údaje boli vyhodnotené pomocou programu GraphPad Prism, GraphPas Software, La Jolla, USA. Tento program sa potom použil na vytvorenie grafov.

Výsledky 30 preskúmaných zmien. Langerhansove ostrovčeky sa však prezentovali nezmenené. Ak boli hladiny kreatinínu u myší s deletovaným Nlrc5 znížené, boli tiež podrobnejšie vyšetrené obličky, glomeruly a tubuly boli nezmenené. Celkovo sa myši s deletovaným Nlrc5 preukázali histologicky bez akýchkoľvek významných zmien vo vzťahu k porovnávacej skupine myší divokého typu.

Výsledky 31 slezina myš Nlrc5 -/- myš divokého typu (C57BL/6) pľúca hrubé lymfatické uzliny oblička pankreas Obr. 7: Bazálna histológia myší s deletovaným Nlrc5 a myší divokého typu zafarbenie HE neukázalo žiadne relevantné rozdiely.

Na výsledkoch záleží 40. Po spracovaní cdna sa merala expresia vybraných cytokínov pomocou PCR v reálnom čase. Expresia interleukínu-lp v myšiach s deletovaným Nlrc5 sa zvýšila 1,7-krát s relatívnou jednotkou 0,0024 (myši štandardného typu: 0,0014). Expresia interleukínu-18 (1,8-násobok), KC (1,4-násobok) a interferónu-y (1,7-násobok) sa tiež zistila v hrubom čreve myší s deletovanou Nlrc5 v porovnaní s hrubým črevom myší štandardného typu. Myši sa zvýšili po 30 dňoch kolitídy DSS. Naopak, TNF-a bol downregulovaný. Zistilo sa, že obsah cdna 0,0006 u myší s deletovaným Nlrc5 bol 0,6-krát nižší ako u myší divokého typu (0,0011) (obrázok 15). Interleukín-12 vykazoval stabilnú expresiu.