Z lekárskej kliniky a polikliniky II - Großhadern
Z lekárskej kliniky a polikliniky II - Großhadern Ludwig-Maximilians-Universität München Komm. Riaditeľ: Prof. Dr. med. A. L. Gerbes vplyv silnej redukcie hmotnosti (diéta vs. žalúdok na rukáve) na zápal a metabolizmus glukózy u obéznych pacientov s diabetom 2. typu Dizertačnú prácu pre získanie doktorského titulu v odbore medicína na Lekárskej fakulte Univerzity Ludwiga Maximiliána v Mníchove predniesla Katrin Widynski z Mníchova 2015
So súhlasom Lekárskej fakulty Mníchovskej univerzity Reportér: Prof. Dr. med. Klaus G. Parhofer Spoluspravodajca: Priv. Doz. DR. Maximilián Bielohuby prof. Dr. Christine Meisinger Spoločný dohľad PhD pracovníčky: Dr. med. Benedikt Aulinger dekan: Prof. Dr. med. dent. Deň ústnej skúšky Reinharda Hickela: 19. novembra 2015
Čestné vyhlásenie, týmto čestne vyhlasujem, že som namiesto prísahy napísal túto dizertačnú prácu na tému Účinok silného úbytku hmotnosti (diéta vs. žalúdok na rukáve) na zápal a metabolizmus glukózy u obéznych pacientov s cukrovkou 2. typu, že som nepoužil žiadne iné okrem uvedených pomôcok a že som urobil všetky zistenia. ktoré boli prebraté úplne alebo približne z literatúry, ako také boli identifikované a identifikované jednotlivo podľa ich pôvodu pomenovaním zdroja. Tiež vyhlasujem, že tu prezentovaná dizertačná práca nebola predložená v rovnakej alebo podobnej podobe inej inštitúcii na účely získania akademického titulu. Miesto, dátum Podpis doktoranda
Obsah Úvod. 1 I Obezita, cukrovka a ateroskleróza. 1 II zápal. 1 III Dôležité peptidy v genéze cukrovky a aterosklerózy. 4 IV Terapeutické možnosti. 8 1 Možnosti konzervatívnej liečby. 8 2 Možnosti chirurgickej liečby. 8 2.1 Reštriktívne postupy. 9 2.2 Reštriktívne postupy s malabsorpčnými zložkami. 9 2.3 Malabsorpčné postupy s obmedzujúcimi zložkami. 9 V Problémy a ciele. 11 B Materiál a metódy. 12 I materiál. 12 metód II. 17 1 Klinicko-experimentálna časť. 17 1.1 Dizajn štúdie a účastníci. 17 1.2 Postup a návštevy. 18 1.3 Operácia žalúdka na rukáve a diéta. 19 1.3.1 Skupina žalúdočných rukávov. 19 1.3.2 Skupina stravovania. 20 1.4 Hyperglykemická a hyperinzulinemická - euglykemická svorka. 20 1.4.1 Hyperglykemická svorka. 21 1.4.2 Hyperinzulinemicko - euglykemická svorka s biopsiou tukového tkaniva. 22 2. časť laboratórneho experimentu. 23 2.1 Elisa a fotometrická metóda merania. 23 2.2 Polymerázová reťazová reakcia. 23 2.2.1 Extrakcia RNA vrátane štiepenia DNázou. 23 2.2.2 Reverzná transkripcia - PCR (RT - PCR). 24 2.2.3 Kvalitatívna PCR. 25 2.2.4 kvantitatívna real-time PCR (qrt-PCR). 26 I.
3 histológia. 28 4 štatistické vyhodnotenie výsledkov. 28 C výsledkov. 29 I Základné údaje účastníkov štúdie. 29 II Dodávka energie a zloženie potravy. 30 III vývoj BMI a zmena obvodu pása. 32 IV zmena hladiny cukru v krvi nalačno, HbA1c a liekov. 33 V Posúdenie svoriek ako základu pre stanovenie inzulínovej rezistencie. 36 VI Zmena citlivosti na inzulín. 37 VII Zmena parametrov zápalu. 40 VIII Histologická analýza tukového tkaniva. 51 D Diskusia. 53 I Príjem energie a chudnutie. 53 II Zlepšenie metabolizmu glukózy. 54 III Zmena zápalu. 56 IV Zmena v NT-ProBNP. 59 V Alternatívne vysvetlenia zlepšenia metabolizmu glukózy. 60 VI Obmedzenia štúdie. 61 E zhrnutie. 63 F Zoznam skratiek. 68 G Zoznam obrázkov. 70 H Zoznam tabuliek. 72 I Bibliografia. 73 J Poďakovanie. 83 II
Nízko obmedzujúca zložka, ktorá sa používa hlavne u pacientov s BMI> 50 kg/m 2 (1, 75). Pri všetkých opísaných laparoskopických výkonoch je perioperačná úmrtnosť menej ako 1% a výber intervencie závisí od viacerých faktorov (napr. BMI, vek, komorbidity) (1). Všetky postupy majú spoločné to, že je dôležitá dôsledná pooperačná starostlivosť, aby sa zabezpečilo trvalé chudnutie a zabránilo sa príznakom nedostatku (1, 75). Obr. 2a: Pás žalúdka, odobratý z (1) Obr. 2b: Rukáv žalúdka, odobratý z (1) Obr. 3a: Žalúdočný bypass Roux-en-Y, odobratý z (1) Obr. 3b: Biliopankreatická diverzia s duodenálnym spínačom, odobratá od (1) 10
Nanášací pufor DNA 6x 10mM Tris (ph 7,6), 0,03% (hmotn./obj.) Brómfenolová modrá, 0,03% (hmotn./obj.) Xyléncyanol, 60% (objem/objem) glycerín, 60 mm EDTA PBS 10 x ( ph 7,4) 1,37 M NaCl, 26,8 mm KCl, 81 mm Na2HP04, PBS 1x (ph 7,4) riedidlo činidla (ph 7,4) TAE 1x TAE 50x gély agarózový gél (1 %) 14,7 mm KH 2P04 10% (v/v) PBS (10x) 10% (v/v) PBS (10%), 1% (w/v) BSA 2% (v/v) TAE (50x) 2 M Tris, 1 M ľadová kyselina octová, 0,05 M EDTA agaróza LE v TAE 1x, súpravy s etídiumbromidom Pre použité súpravy sa použili dodané roztoky a pufre podľa protokolu výrobcu. Sada RNázy bez RNázy Qiagen, Hilden, Nemecko RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Nemecko SuperScript III First-Strand Synthesis System Invitrogen, Karlsruhe, Germany Enzyme Pri použití enzýmov boli použité roztoky a pufre odporúčané a dodávané výrobcom. AmliTaq Gold DNA Polymerase Applied Biosystems, Carlsbad, USA (5 U/ul) deoxyribonukleáza I, Amplification Invitrogen, Karlsruhe, Nemecko Stupeň (1 U/µl) Taq DNA Polymeráza, rekombinantný Invitrogen, Karlsruhe, Nemecko (5 U/ul) PCR primer ( Eurofins MWG Operon, Ebersberg) sekvencia primérov (5-3) GAPDH (hm) dopredu agggctgcttttaactctggt GAPDH (hm) reverzne ccccacttgattttggaggga 13
Testy génovej expresie TaqMan (Applied Biosystems, Carlsbad, USA) Referenčná sekvencia cieľového génu (človeka) Objednávkové číslo TNF alfa NM_000594.2 Hs00174128_m1 MCP-1 NM_002982.3 Hs00234140_m1 IL-6 NM_000600.3 Hs00985639_m1 NM11193377.1 Hs00985639_s10005600 FN1 fibronektínu NM_002026.2 Hs00365052_m1 adiponektínu NM_001177800.1 Hs00605917_m1 RBP4 NM_006744.3 Hs00198830_m1 Vaspin (Serpina12) NM_173850.2 Hs005451801_m1, referenčné NM73850.2 Hs005451801, referenčné NM7451801, referenčné číslo USA, NM7Bsequenzin systémy, referenčné číslo bolo priradené LightCycler-Bsequenzin, USA_genieds101, USA, NM7Bsequenzin merané klinickou chémiou v nemocnici. Súpravy Elisa na vzorky ľudskej plazmy sa používali vždy. Parameter Výrobca Objednávkové číslo TNF-a ultravysoký R&D Quantikine KHC3014 Leptin R&D Quantikine DLE00 MCP-1/CCL2 R&D Quantikine DCP00 Adiponectin R&D Quantikine DRP300 Resistin R&D Quantikine DRSN00 Fibronectin Abcam AB1088948 NT-ProBNP DRik4150R6 online-AB10 Výskum a vývoj Quantikine HS600B 14
2.2.2 Reverzná transkripcia - PCR (RT - PCR) Pretože RNA nemôže fungovať ako templát pre DNA polymerázu, musí sa najskôr prepísať do cdna (kópia DNA) (reverzná transkripcia). Toto sa uskutočnilo s použitím syntetického systému SuperScript III First-Strand Synthesis System pre RT-PCR od výrobcu Invitrogen. Reverzná transkripcia sa skombinovala s PCR na amplifikáciu cdna. Na denaturáciu RNA sa použil prístup 1 a je uvedený v tabuľke 2. Pretože koncentrácia izolovanej RNA z bioptického tuku bola veľmi nízka, 8 ul zodpovedalo maximálnemu dostupnému množstvu RNA. Po inkubácii počas 5 minút pri 65 ° C a ochladení počas 1 minúty na ľade sa pridala druhá dávka, ktorej zložky sú uvedené v tabuľke 3. Potom sa začal program RHRT PCR, ako je uvedené v tabuľke 4. Tabuľka 2: Reakčná zmes (jednoduchá) na denaturáciu RNA Vzorka RNA natrávenej DNázou 8 μl Náhodný hexamérny primér 1 μl dntp s (10 mm) 1 μl 10 μl Tabuľka 3: Reakčná zmes (jednoduchá) pre zmes syntézy cdna 10 x RT pufor 2 ul MgCl2 (25 mM) 4 ul DTT (0,1 M) 2 ul RNaseOUT 1 ul SuperScript III RT 0,5 ul vody upravenej pomocou DEPC 0,5 ul 10 ul 24
Tabuľka 4: Program PCR reverznej transkripcie v PCR termocykléri Teplota Trvanie Krok 25 C 10 minút Žíhanie 50 C 50 minút Syntéza Cdna 85 C 5 minút Ukončenie 4 C koniec 2.2.3 Kvalitatívna PCR Preukázanie úspešnej transkripcie trávenej DNázou Pre RNA v cdna sa uskutočnila kvalitatívna PCR. Ako referencia bol špecifikovaný ľudský GAPDH (glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza). Použila sa Taq DNA polymeráza (rekombinantná, 5 U/μl) od spoločnosti Invitrogen a činidlá obsiahnuté v súprave (tab. 5). Program PCR sa uskutočňoval v PXE 0.2 Thermal Cycler (Thermo Electron Corporation) a je uvedený v tabuľke 6. Tab. 5: Reakčná dávka (jednoduchá) pre štandardnú PCR (kontrolná GAPDH) 10x PCR pufor 2 ul dntp zmesi (10 mM) 0,4 ul MgCl2 (50 mM) 0,6 ul priméru pre 1 ul primeru rev 1 ul templátu cdna 1 µl Taq DNA polymerázy (5U/µl) 0,2 µl ddh201 14 µl 20 µl 25