Zložky potravy a ich vplyv na patogenézu autoimunitnej cukrovky u ľudí a
1 TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN Predseda pre výživovú fyziológiu Výživové zložky a ich vplyv na patogenézu autoimunitného diabetu u ľudí a myší Daniela Bettina Müller Kompletná kópia dizertačnej práce schválenej Vedeckým centrom pre výživu, využitie pôdy a životné prostredie Technickej univerzity v Mníchove Weihenstephan na získanie akademického titulu schválenej dizertačnej práce. Doktor vied o domácnosti a výžive predseda: skúšajúci dizertačnej práce: Univ.-Prof. DR. J. J. Hauner 1. Univ.-Prof. DR. H. Daniel, 2. aplikácia, prof. Dr. A-G. Ziegler Dizertačná práca bola predložená na Technickú univerzitu v Mníchove dňa a prijatá Weihenstephan Science Center for Nutrition, Land Use and Environment dňa.
2 Za mojich dvoch dedov
3 Obsah Obsah 1 Úloha Úvod a prehľad literatúry Základy cukrovky 1. typu Význam genetiky Patogenéza a imunologické pozadie cukrovky 1. typu Pšenica a jej bielkovinové frakcie Celiakia a súvislosť medzi cukrovkou 1. typu a celiakiou Vplyv pšeničných bielkovín na vývoj autoimunitného cukrovky na zvieracích modeloch Diabetes typu 1 Vplyv stravovacích faktorov na vývoj autoimunitného diabetu vo zvieracom modeli kravského mlieka a jeho proteínových frakcií Vplyv proteínov kravského mlieka na vývoj autoimunitného diabetu vo zvieracom modeli Vplyv pšenice a kravského mlieka na ľudský diabetes typu 1 Asociácia medzi imunitným systémom spojeným s črevami a autoimunitným diabetom Ďalšie zložky potravy a ich možný potenciál Asociácia s diabetom 1. typu Materiál a metódy Vyšetrovanie na myšom modeli NOD Skupina myší Diéty Protokol Čiastočný experiment 1 a 1a Protokol Čiastočný experiment Protokol Čiastočný experiment I.
4 Obsah 3.2 Experimentálne metódy Extrakcia zŕn na získanie proteínových frakcií Produkcia proteínových extraktov z potravy alebo krmiva Elektroforetická separácia proteínových frakcií (SDS-Page) Stanovenie obsahu proteínov vo výťažkoch Meranie autoprotilátok proti IgG v myšom a ľudskom sére Stanovenie väzby rádioligandu so zložkami potravy IAA afinita s kuracím inzulínom IgA meraním autoprotilátok na inzulín v ľudských sérach Štatistiky Výsledky Kŕmne experimenty s NOD myšami Spotreba potravy a vývoj hmotnosti NOD myší v experimentálnych skupinách Čiastočný experiment 1 Krmivo obsahujúce pšenicu a kazeín v porovnaní so základnou stravou Kumulatívne riziko cukrovky NOD myší v čiastočnom experimente prevalencie inzulínových autoprotilátok NOD myši vo veku desiatich týždňov života v čiastočnom experimente Výskyt cukrovky u NOD myší pred a po 25 týždňoch života v čiastočnom experimente čiastočný experiment 2 Kvantifikácia zložiek pšenice a pšenice a kvalita extrahovaných pšeničných frakcií Kumulatívne riziko cukrovky NOD myší v čiastočnom teste Prevalencie inzulínových autoprotilátok NOD myší vo veku desiatich týždňov v čiastočnom teste II
6 Obsah 5.1 Pokusy o kŕmenie s NOD myšami Účinky rôznych zdrojov bielkovín na vývoj cukrovky v modeli NOD Účinky rozložených doplnkov pšenice a jednotlivých frakcií pšeničných bielkovín na vývoj cukrovky v modeli NOD Vplyv ďalších zložiek potravy v strave malých detí na vývoj cukrovky v modeli NOD Záverečné zváženie nutričných experimentov na NOD -Modelová reaktivita autoprotilátok ľudského inzulínu s kuracím inzulínom a meranie izotypov IgA Väzbové vlastnosti inzulínových autoprotilátok na kurací inzulín v ľudských sérach Identifikácia izotypov IgA inzulínových autoprotilátok v ľudských sérach Záverečné zváženie testov na väzobné vlastnosti a izotypy väzbových vlastností inzulínu autoprotilátky na väzbu inzulínu autoprotilátky na väzbu inzulínu autoprotilátky na autoprotilátky inzulínu na autoprotilátky inzulínu. Vyšetrovanie väzby autoprotilátok na inzulín na jednotlivé proteíny so zložkami potravy v ľudských sérach Frakcie kravského mlieka Konečné posúdenie testov na krížovo reaktívne inzulínové autoprotilátky Vyhliadky do budúcnosti Zhrnutie a závery Literatúra IV
7 Obsah Obsah. Zoznam obrázkov. Zoznam tabuliek. Zoznam skratiek. I-V VI-VIII IX-X XI Predchádzajúce publikácie. XII životopis. XIII-XIV vďakyvzdania. XV V
10 Zoznam obrázkov Obr. 26 Väzba IAA na mlieko, mliečne bielkoviny, recepty a pšenica v porovnaní s ľudským inzulínom Obr. 27 Väzbové krivky IAA na zložky potravy 75 Obr. 28 Väzbové krivky IAA na mliečne bielkoviny Obr. 29 Väzba IAA na rôzne mliečne bielkoviny v porovnaní s Inzulín (časť 1) Obr. 30 Väzba IAA na rôzne mliečne bielkoviny v porovnaní s inzulínom (časť 2) Obr. 31 Väzba IAA na rôzne mliečne bielkoviny v porovnaní s inzulínom (časť 3) VIII
12 Zoznam tabuliek Tab. 20 Analýza koncentrácie bielkovín v extrahovaných potravinových roztokoch v rôznych zriedeniach a výsledné stredné hodnoty Tab. 21 Charakteristiky testovaných osôb, ktorých IAA sa viaže na extrakt sušeného mlieka X
13 Zoznam skratiek Zoznam skratiek Obr. Obrázok AK Protilátka asparagín cpm rádioaktívne sa rozpadá za minútu (počet za minútu) GAD (A) (protilátky proti) glutamát dekarboxyláza HLA histokompatibilný komplex (ľudský leukocytový antigén) I (A) A Inzulín (auto) protilátka IA-2 ( A) (protilátky proti) proteín tyrozín fosfatáza IA-2 ICA protilátky ostrovčekových buniek Ig imunoglobulín MHC hlavný histokompatibilný komplex min. Minúty nb neznáme NOD neobézny diabetický RBA test väzby rádioligandu rpm počet otáčok za minútu T1D diabetes typu 1 Tab. Tabuľka TBST Tris pufrovaný soľný roztok plus Tween TBT Tris pufrovaný Tween t-tg tkanivová tranglutamináza vs. vs. Svetová zdravotnícka organizácia WHO ZnT8 transportér zinku 8 XI
16 úloh, ktoré by sa dali považovať za potenciálne počiatočné cieľové antigény IAA. Celkovo by táto práca mala zistiť možný vplyv jednotlivých zložiek potravy na imunitný proces autoimunitného diabetu. Pomocou údajov získaných in vivo na modeli NOD sa testujú potenciálne diabetogénne zložky potravy na ľudských sérach. Pomocou týchto modelov in vitro sa bude skúmať, do akej miery by sa imunitné udalosti diabetu typu 1 mohli spočiatku vyvolať krížovými reakciami so zložkami potravy. Výsledky týchto experimentov môžu opisovať ďalšie, doteraz neznáme mechanizmy patogenézy cukrovky, a môžu sa teda použiť na vývoj primárnych terapií na prevenciu rozvoja cukrovky 1. typu v ranom detstve. 3
41 Materiál a metódy (strava D), druhá skupina zostala na strave obsahujúcej pšenicu A a tretia skupina zostala na strave bez pšenice. 9 samíc zvierat, ktoré zostali na diéte C (pozri obr. 4). Chovné páry Bezlepková diéta obsahujúca kazeín B Bezlepková a kazeínová diéta C Testovacie skupiny Diéta B n = 12 Diéta A n = 12 Diéta D n = 12 Diéta C n = 9 Obr. 4 Pridelenie samíc NOD myší chovným a testovacím skupinám v čiastočnom teste 1. Samce mladých zvierat chovnej skupiny bezlepkovej diéty B sa po laktácii vo veku troch týždňov oddelili od matiek, ako je to opísané pre samice, a rozdelili sa do troch testovacích skupín. Analogicky k zoskupeniu samíc myší jedna zo skupín dostávala referenčnú stravu (diéta D), druhá dostávala stravu obsahujúcu pšenicu A a tretia skupina zostávala na bez pšeničnej diéte B (pozri obr. 4a). Chovné páry bezlepková diéta obsahujúca kazeín B Testovacie skupiny Diéta B n = 11 Diéta A n = 10 Diéta D n = 12 Obr. 4a Pridelenie samčích NOD myší chovným a testovacím skupinám v čiastkovom experimente 1a. 28
46 Materiál a metódy Aby sa od seba oddelili proteínové frakcie obsiahnuté v pšenici, uskutočnila sa modifikovaná trojstupňová extrakcia, pričom v prvom kroku extrakcie boli v supernatante prítomné albumíny a globulíny, v druhom extrakčnom kroku boli v supernatante obsiahnuté prolamíny (gliadíny) a s V poslednom kroku sa gluteníny separovali (Wilson a Goulding 1991, Mimouni a kol. 1998, Nicolas a kol. Idris a kol. 2003). Extrakcia albumínov z múky a globulínov Centrifugácia> 2x sediment Extrakcia gliadínom Centrifugácia> 3x Glutelínová extrakcia sedimentu (atmosféra N2) Centrifugácia> 2x centrifugácia všetkých supernatantov Zrážanie Skladovanie pri 18 ° C Obr. 7 Schéma extrakcie proteínov a separácia frakcií z pšeničnej múky. Navážilo sa 0,1 g komerčnej pšeničnej múky typu 550, pridal sa 1 ml tlmivého roztoku Sörensen (pH 7,35) a zmes sa trepala pri teplote 4 ° C počas 20 minút. Po centrifugácii (20 minút, 1 000 ot./min., Centrifúga Sorvall RC 5B Superspeed Centrifuge) pri 4 ° C sa supernatant odstránil a sediment sa po pridaní Sorensenovho pufru znova extrahoval rovnakým spôsobom. Dva supernatanty sa spojili a skladovali pri 4 ° C, kým sa nedokončili ďalšie extrakčné kroky. 33
60 výsledkov Získanie množstva albumínov a globulínov, ktoré boli podávané NOD myšiam pitnou vodou. Na overenie metódy extrakcie boli hlavné proteíny pšeničnej múky frakcionované a čistota separácie bola skontrolovaná pomocou gélovej elektroforézy (materiál a metódy 3.2.3). Štandardné albumíny a globulíny Gluteníny Gliadíny Obr. 10 Elektroforetické oddeľovanie frakcií pšeničného proteínu na 12% polyakrylamidovom géli. Jednotlivé proteínové frakcie sú priradené k príslušným pásom a molekulové hmotnosti sú uvedené v kda na ľavej strane. Účinnosť extrakcie sa navyše stanovila kvantitatívnym stanovením proteínu pomocou súpravy BCA Protein Assay Kit (pozri Tab. 16 a Materiál a metódy 3.2.4) a ako základ extrakcie sa použil približne 50% výťažok požadovanej frakcie albumínu a globulínu. umiestnené. 47