Analýza génovej expresie v smaragdovom popolavom (Agrilus planipennis) pomocou kvantitatívneho reálneho

Zhrnutie

Kvantitatívna real-time PCR (qRT-PCR) je efektívnym nástrojom na diagnostiku hladín mRNA v rôznych hmyzích tkanivách a vývojových štádiách. V tejto správe demonštrujeme použitie qRT-PCR na stanovenie hladín mRNA v rôznych larválnych tkanivách a vývojových štádiách invazívnych druhov hmyzu, vrtákov smaragdového popola.

Abstrakt

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) je exotický invázny škodca, ktorý zabil milióny jaseňov (Fraxinus spp) v Severnej Amerike. EAB sa naďalej rýchlo šíri a napáda jaseňové stromy rôzneho veku, od stromčekov až po stromy. Doteraz však pre EAB existuje len veľmi málo alebo žiadne molekulárne znalosti. Zaujíma nás dešifrovanie molekulárnych základov fyziologických procesov v tkanive, ktoré pomáhajú EAB pri úspešnej kolonizácii jaseňov. V tejto správe ukazujeme efektívne využitie kvantitatívnej PCR v reálnom čase (qRT-PCR) na skúmanie hladín mRNA v rôznych štádiách larválneho tkaniva (vrátane tukového tkaniva v strede čreva a kutikuly) a v rôznych vývojových štádiách (vrátane 1. štádia - 2. Štádium - 3. Rd, 4. instary, prepupae a dospelí) od EAB. Ako príklad sa použije peritrofínový gén (tu pomenovaný AP-PERI1) ako požadovaný gén a príklad ribozomálneho proteínu (AP-RP1) ako vnútorná kontrola. Peritrofíny sú dôležitými zložkami peritrofickej membrány/matrice (PM), ktorá je výstelkou čriev hmyzu. PM má rôzne funkcie, ako je trávenie a mechanická ochrana epitelu stredného čreva.

Protokol

Celý protokol s rôznymi krokmi zobrazenými vo vývojovom diagrame na obrázku 1. Jednotlivé kroky sú disekcia, extrakcia RNA, syntéza cDNA prvého vlákna a qRT-PCR sú opísané nižšie.

II. Extrakcia RNA (podľa protokolu výrobcu o použití činidla Trizol)

  1. Na začatie extrakcie RNA najskôr pomocou plastových tyčiniek zhomogenizujte tkanivá v Trizole pomocou 1,5 ml skúmaviek Eppendorf. Po homogenizácii sa celkový objem každej vzorky upraví pomocou Trizol reagentu na 1 ml.
  2. Vo vývojových štádiách celé zviera homogenizujte v tekutom dusíku pomocou paličky a trecej misky. Potom pridajte alikvotnú časť homogenátu (50 μg) k 1 ml Trizolu.

  1. Inkubujte skúmavky so vzorkou s 1 ml Trizolu počas 15 minút pri izbovej teplote.
  2. Po inkubácii pridajte do každej skúmavky 200 μl chloroformu. Ihneď po pridaní chloroformu sa skúmavky intenzívne pretrepávajú asi 15 sekúnd. Potom udržujte skúmavky pri izbovej teplote ďalšie 2 - 3 minúty.
  3. Potom vzorky centrifugujte pri 12 000 xg počas 15 minút pri 2 ° C. Po centrifugácii je RNA vo vodnej fáze. Objem vodnej fázy by mal byť 600 μl alebo 60% z celkového objemu Trizolu.

  1. Opatrne odstráňte iba vodnú fázu. Prítomnosť látok pod vodnou fázou kontaminuje extrahovanú RNA. Potom preneste vodnú fázu do vhodne označenej 1,5 ml skúmavky Eppendorf.
  2. Na vyzrážanie RNA z vodnej fázy zamiešajte do každej skúmavky 0,5 ml izopropylalkoholu. Inkubujte vzorky pri izbovej teplote 10 minút. Po inkubácii centrifugujte pri 12 000 xg 10 minút pri 2 ° C.

  1. Po centrifugácii odstráňte supernatant z skúmaviek. RNA sa vytvára v gélovitej pelete na dne skúmavky. Peleta sa premyje 75% etanolom a na 1 ml Trizolu sa pridá najmenej 1 ml 75% etanolu. Premiešajte vírením. Potom centrifugujte pri 7500 Xg po dobu 5 minút pri 2 ° C.

  1. Zlikvidujte supernatant z skúmaviek. Znovu centrifugujte v malej stolnej centrifúge po dobu 1 minúty. Opatrným pipetovaním odstráňte prebytočný supernatant z skúmavky. Skúmavku nechajte otvorenú a peletu nechajte 5-10 minút sušiť na vzduchu. Uistite sa, že máte suchú peletu, pretože to výrazne zníži jej rozpustnosť.
  2. Po vysušení na vzduchu bola peleta upravená vo vode upravenej pomocou dietylpyrokarbonátu alebo DEPC. Množstvo vody použitej na resuspendovanie pelety závisí od veľkosti pelety. Na malú peletu použite 50 μl upravenej vody DEPC alebo na veľkú peletu 100 μl. Peletu nechajte úplne rozpustiť vo vode upravenej pomocou DEPC niekoľkonásobným posunutím hrotu pipety hore a dole.
  3. Po rozpustení pelety vložte vzorku na 10 minút pri teplote 55 ° C.
  4. Potom zmerajte koncentráciu každej vzorky RNA pomocou spektrofotometra Nanodrop (2 μl vzorky RNA).
  5. Skladujte vzorky RNA pri -80 ° C až do ďalšieho použitia.

III. Syntéza cDNA prvého vlákna (podľa protokolu výrobcu so súpravou syntézy prvého vlákna SuperScript od spoločnosti Invitrogen.)

Dizajn primérov a stanovenie referenčného génu

    Dizajnový základný náter s teplotou topenia (Tm) 60 ° C a veľkosťou produktu

100 bp.

  • Ako gén záujmu pre tento experiment sa používa AP-PERI1. Pre neskoršiu analýzu a normalizáciu údajov je potrebný referenčný gén alebo systém vnútornej kontroly. Ako referenčný gén pre tento experiment sa používa ribozomálny proteín (AP-RP1).
  • Pripravte si päť pracovných zásob primerov, ktoré sa použijú, vrátane vášho referenčného génu.

    • Príprava noriem

    1. Na výpočet účinnosti použitých primérov by sa mali pripraviť štandardy.
    2. Vytvorte zmes cDNA z rôznych vzoriek, ktoré sa testujú.
    3. Pripravte 5-násobné sériové riedenie pre akýkoľvek bod v grafe. Stačiť by mali štyri zriedenia, ale veľmi sa odporúča päť.
    4. Objem sa líši podľa toho, koľko bodov a koľko technických replík sa používa. Pre každý testovaný gén by malo stačiť vytvoriť štandard s príslušným referenčným génom.

    1. Šablóna návrhu zobrazuje názov vzorky pre každú jamku na doštičke qRT-PCR. Pamätajte, že pre každý gén existujú štandardy a minimálne dve technické repliky na vzorku.

    Nastavte parametre kolesa

    1. Zapnite prístroj qRT-PCR a zadajte parametre kolesa. Parametre PCR pre tento experiment sú nasledujúce:
      Krok 1:
      • 1 cyklus: 95 ° C 3 min
      Krok 2:
      • 40 cyklov: 95 ° C 15 s, potom 60 ° C 30 s
        (Voliteľné: na stanovenie krivky topenia zahrňte nasledujúce kroky.)
      Krok 3:
      • 1 cyklus: 95 ° C 1 min
      Krok 4:
      • 1 cyklus: 55 ° C 1 min
      Krok 5:
      • 81 cyklov: 55 ° C 30 s

    Pripravte dosku pre stroj CFX96 (BioRad)

    V. Schematické znázornenie experimentu

    génovej
    Obrázok 1: Vývojový diagram ukazujúci postupnosť krokov na preskúmanie génovej expresie.

    expresie
    Obrázok 2: A) Larválna EAB disekcia ukazuje stredné črevo uprostred. B) izolované stredné črevo lariev EAB

    expresie
    Obrázok 3: A) Priemerné hodnoty relatívnej expresie (otáčky) pre peritrofínový gén (AP-PERI1) v rôznych štádiách larválneho tkaniva vrátane kutikuly (Cu), stredného čreva (MG) a tukového telieska (FB). EAB špecifický ribozomálny proteín (tu pomenovaný, AP-RP1) sa použil ako vnútorná kontrola na normalizáciu údajov pre požadovaný gén, AP-PERI1. B) Relatívna násobná zmena AP-PERI1 v tkanivách lariev. Tkanivo kutikuly vykazovalo najmenšiu expresiu, a preto sa použilo ako vzorka kalibrátora (1X) (Pfaffl, 2001).

    agrilus
    Obrázok 4: A) Priemerné hodnoty relatívnej expresie (otáčky) pre gén peritrofínu (AP-PERI1) v rôznych vývojových štádiách EAB vrátane larválnych štádií (1., 2., 3. a 4.), prepupae (PP) a dospelých (A). EAB určený ribozomálny proteín (AP-RP1) sa použil ako vnútorná kontrola na normalizáciu údajov získaných pre požadovaný gén, AP-PERI1. B) Relatívna násobná zmena AP-PERI1 v rôznych štádiách vývoja. Vzorka PP vykazovala najnižšiu hladinu hladiny mRNA, a preto bola odobratá ako kalibrátor (1 vzorka).

    Kvantitatívna PCR v reálnom čase (qRT-PCR) je efektívnym nástrojom na diagnostiku hladín mRNA v rôznych tkanivách hmyzu a vývojových štádiách. Ďalej má qRT-PCR väčšinou ústredný nástroj na overovanie údajov generovaných analýzami génovej expresie s vysokou priepustnosťou, ako sú mikročipy a nová generácia RNA-Seq.

    Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

    Diskusia

    Hodnota prahových cyklov (Ct) pre každú vzorku sa získa na doštičke qRT-PCR. Na vytvorenie štandardnej krivky sa vyniesla hodnota Ct získaná pre každé riedenie proti logu koncentrácie. Hodnoty Ct pre experimentálne vzorky sa potom vyniesli na túto sériu štandardných riedení kriviek. Cieľové množstvá sa vypočítali zo samostatných štandardných kriviek pre každý experiment, tj. Generuje sa tkanivová a vývojová expresia. Relatívne hodnoty expresie (otáčky) sa potom určili vydelením množstiev sledovanej cieľovej sekvencie (v tomto prípade AP-PERI1) množstvom získaným pre systém vnútornej kontroly (AP-RP1). Čo je dôležité pre výpočty, protokoly REV pre každý gén sa analyzovali pomocou ANOVA (analýza odchýlky) pomocou postupu PROC MIXED od SAS (SAS Institute Inc. SAS/STAT Users Guide, verzia 9.1). Význam výrazu bol požadovaný pri prihlásení k odberu. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

    Zverejnenie

    Neboli vyhlásené žiadne konflikty záujmov.

    Poďakovanie

    Uznávame pomoc, ktorú pri príprave experimentov poskytla Lourdes Delta Arrueta Antequera (Katedra entomológie, Ohio State University/OARDC, Wooster, OH). Ďakujeme Dr. Therese Poland (USDA, Forest Services, NRS) za zasielanie vzoriek lariev EAB. Pomoc poskytnutú Dr. Luis A Canas a Nuris M Acosta s nastavením mikroskopu sú vítaní. Finančné prostriedky na tento projekt boli získané zo štátnych a federálnych fondov poskytnutých Ohio Agricultural Research and Development Center, The Ohio State University.