Analýza zloženia tela a metabolického umiestňovania v protokole myší s vysokým obsahom tukov (preložené do nemčiny)
Zhrnutie
Tento protokol popisuje použitie analýzy zloženia tela a systému monitorovania metabolizmu zvierat na charakterizáciu zloženia tela a metabolických parametrov u myší. Model obezity vyvolaný kŕmením s vysokým obsahom tukov slúži ako príklad použitia týchto techník.
Abstrakt
Dôležitú informáciu o základných mechanizmoch ochorenia môžu poskytnúť zmeny v zložení tela (tuk alebo chudá hmota), metabolické parametre, ako je spotreba kyslíka v tele, výdaj energie a využitie substrátu a správanie, ako je príjem potravy a fyzická aktivita. Vzhľadom na dôležitosť stavby tela a metabolizmu, rozvoja obezity a jej následných následkov je potrebné v predklinickom výskume prijať presné opatrenia týchto parametrov. Pokrok v technológii za posledných niekoľko desaťročí umožnil neinvazívnym a pozdĺžnym spôsobom odvodenie týchto opatrení na modeloch hlodavcov. Vo výsledku sa tieto metabolické opatrenia osvedčili pri hodnotení reakcie na genetické manipulácie (napr. Knockout alebo transgénne myši, vírusové odbúravanie alebo nadmerná expresia génov), experimentálny skríning liekov/zlúčenín a diétna, behaviorálna alebo fyzická aktivita Zásahy. Tu popisujeme protokoly na meranie zloženia tela a metabolických parametrov pomocou systému dohľadu nad zvieratami u myší kŕmených chow a high-fat-diet.
Úvod
Metabolizmus je podporovaný mnohými aspektmi normálnej fyziológie buniek, orgánov a celého tela. Výsledkom je, že pri vzniku rôznych chorôb môžu zmeny metabolizmu priamo prispievať k základnému ochoreniu alebo môžu byť ovplyvnené ako vedľajší účinok patológie. Metabolický výskum a štúdie energetickej rovnováhy sa tradične zameriavajú na oblasť obezity a súvisiacich stavov, ako je inzulínová rezistencia, prediabetes, intolerancia glukózy, kardiovaskulárne choroby a cukrovka. Tento výskum je oprávnený z hľadiska rastúcej prevalencie týchto podmienok na celom svete a individuálnych, spoločenských a ekonomických nákladov, ktoré tieto podmienky spôsobujú. Vývoj preventívnych stratégií a nových terapeutík zameraných na obezitu je teda trvalým cieľom vo výskumných laboratóriách po celom svete a pre tieto štúdie sa vo veľkej miere používa predklinické modely myší.
V tomto protokole poskytujeme priamy popis použitia analýzy zloženia tela na hodnotenie zloženia tela u myší a systému monitorovania metabolizmu zvierat na meranie aspektov metabolizmu. O úvahách a obmedzeniach pre tieto techniky sa diskutuje spolu s navrhovanými metódami analýzy, interpretácie a prezentácie údajov.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Protokol
Všetky opísané experimenty boli schválené Alfred Medical Research Education Precinct Animal Ethics Committee (AMREP AEC) a o myši sa staralo humánne v súlade s austrálskymi smernicami National Health and Medical Research Council (NHMRC) o testovaní na zvieratách. Zvieratá dostali predpísanú stravu a vodu ad libitum a boli umiestnené v prostredí s kontrolovanou teplotou (
21-22 ° C) so cyklom 12 hodín svetla a 12 hodín tmy. Sedemtýždňové myši (na pozadí C57Bl/6J) boli kŕmené buď pravidelnou stravou (energetický obsah 14,3 MJ/kg, tvorený 76% kJ zo sacharidov, 5% tuku, 19% bielkovín; pozri tabuľku Materiály) alebo pre skupinu s vysokým obsahom tukov diéta s vysokým obsahom tukov (HFD) (), energetický obsah 19 MJ/kg, pozostávajúci z 36% sacharidov, 43% tuku, 21% bielkovín, špeciálne krmivá kJ) po dobu 3 týždňov. Zloženie telesnej hmotnosti a výšky pomocou prístroja EchoMRI sa robilo každý týždeň, zatiaľ čo sledovanie metabolickej analýzy v mušle sa robilo po 3 týždňoch diéty.
(1) Postup analyzátora zloženia tela
Poznámka: Pre optimálne fungovanie by zariadenie EchoMRI 4 v 1 použité v tomto protokole malo byť umiestnené v miestnosti, kde je stabilná teplota vzduchu a nekolíše. V ideálnom prípade by to malo byť neustále monitorované. Ak je to možné, vyvarujte sa prerušeniam napájania stroja. Ak bolo prerušené napájanie a je potrebné reštartovať systém, nechajte stroj pred ďalším použitím aspoň 2 - 3 hodiny zahriať. Skôr ako začnete, uistite sa, že máte nasadené správne osobné ochranné prostriedky.
2. Monitorovanie postupu metabolického systému zvierat
Poznámka: Systém vyžaduje
2 h na zahriatie a stabilizáciu. Keď je stroj vypnutý, musí byť zapnutý, aby sa bunka oxidu zirkoničitého mohla zahriať na 725 ° C. Myši tiež zvyčajne umiestňujeme do analyzátora zloženia tela deň pred vstupom do zvieraťa, monitorovací systém, problémy s Neochota vyhnúť sa stresu.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Reprezentatívne výsledky
Výsledky na obrázku 3 je zrejmé, že naznačuje typickú zmenu parametrov zloženia tela pri vysokom príjme tukov, meranú pomocou EchoMRI. Na začiatku nebol žiadny rozdiel v žiadnom meranom parametri (obr. 3A-F.). Avšak už po 1 týždni stravovania s vysokým obsahom tukov došlo v skupine s HFD k významnému zvýšeniu telesnej hmotnosti, tukovej hmoty a percentuálneho podielu tukového tuku (obr. 3A),B.,D.). Počas 3-týždňovej dietetickej intervencie sa rozsah rozdielov medzi týmito dvoma skupinami týchto opatrení naďalej zvyšoval. Svalová hmota, voľná voda a celkový obsah vody (obrázok 3,E.,F.) v žiadnom okamihu nerozlišujú medzi skupinami. Je tiež zrejmé, že myši Chow pokračovali v priberaní počas sledovaného obdobia (obrázok 3A) kŕmené, išlo o nárast chudej hmoty (obrázok 3) namiesto zvýšenia tukovej hmoty (obr. 3 b.)).
RER bol signifikantne nižší u myší s vysokým obsahom tukov, čo naznačuje využitie tuku nad využitím uhľohydrátov pri diéte s vysokým obsahom tukov (obr. 5A)) kŕmené. Spotreba energie (teplo) bez normalizácie sa stala ťažším zvieraťom, pravdepodobne kvôli tomu, že zvieratá mali viac metabolicky aktívneho tkaniva (obr. 5b)), pričom tento rozdiel sa stratil po normalizácii na telesnú hmotnosť (obrázok 5) zvýšené. Všimnite si tiež zvýšenie VO2, RER a výdaj energie v cykle tmy v porovnaní s cyklom svetla, keď sú myši aktívnejšie. Tieto rozdiely predstavujú klasické denné zmeny v metabolizme, ktoré sa vyskytujú u myší. Zatiaľ čo v tomto príklade sme dáta rozdelili do 12 h blokov, môže byť užitočné aj delenie dát ďalej na menšie časové epochy. Fyzická aktivita je tiež faktorom, ktorý prispieva k výdaju energie. Tieto sa medzi skupinami nelíšili, čo naznačuje, že pokles cvičení nebol hybnou silou obézneho fenotypu u myší s vysokým obsahom tuku (obrázok 5)).
štatistika
Všetky údaje v tomto dokumente sú uvedené ako priemer ± štandardná chyba priemeru (SEM). Štatistická významnosť pokračovala na p Obrázok 1 : Správne umiestnenie nákladov na myši a držiteľov vzoriek malých zvierat s myšami v rámci analýzy tela zloženia. Vykonajte test systému so štandardnou kalibráciou (cena) alebo na skenovanie myší v držiaku vzoriek malých zvierat, každý v portálovom systéme. Červené šípky ukazujú valec, v ktorom budú myši umiestnené v hypostylovej hale stroja.
Obrázok 2 : Zostavenie jednotlivých komôr. (A) umiestnite nádobu na potraviny do stredu váhy. B) umiestnite plošinu do každej komory a vložte komoru nad lievik. C) Myši v komorách jednotlivo a zakryte. D) umiestnite a zaistite fľašu s vodou.
Obrázok 3 : Analýza tela zameraná na zloženie tela počas 3 týždňov diéty s vysokým obsahom tukov. (A) telesná hmotnosť, (B) Tuková hmota, (C) odmietnuť dav, (D) Tuková hmotnostná frakcia, (E) Obsah vody, zadarmo a (F) Celkový obsah vody. Kruhy predstavujú bežné stravovacie diéty, štvorce predstavujú HFD. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.
Obrázok 4 : Metabolické parametre získané z monitorovacieho systému metabolických zvierat po 3 týždňoch príslušných diét. Myši boli umiestnené v komorách po dobu 48 hodín, prvých 24 hodín ako indukcia. Údaje z druhých 24 hodín sa analyzovali a uviedli v týchto číslach. (A) Surové ceny VO2, B) VO2 sa normalizoval na telesnú hmotnosť (C) VO2 sa normalizoval na svalovú hmotu, (D) Scatterplot pre neupravenú hmotnosť tela VO2 (celkovo 24 hodín), t a (E) neupravená chudá telesná hmotnosť VO2. A-C Biele pruhy predstavujú normálnu stravu, čierne pruhy predstavujú stravu s vysokým obsahom tukov. D-E Kruhy predstavujú bežné stravovacie diéty, štvorce predstavujú HFD. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.
Obrázok 5 : A) Pomer výmeny dýchania (RER), (B) Teplo (spotreba energie) a (C) Teplo normalizované na telesnú hmotnosť. D) Úroveň aktivity vypočítaná ako súčet ambulantných lúčov X a Y, zlomov a zlomov lúča Z. Biele pruhy predstavujú normálnu stravu; čierne pruhy predstavujú HFD.
Obrázok 6 : Údaje o príjme potravy do systému za posledných 24 hodín. (A) Príjem potravy v gramoch, (B) Príjem potravy normalizovaný na telesnú hmotnosť a (C) vypočítaná spotreba energie. n = 4-5 (3 myši boli vylúčené kvôli veľkému neporiadku s ich jedlom). Biele pruhy predstavujú normálnu stravu; čierne pruhy predstavujú HFD. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Diskusia
Dôležité kroky
Tu popísané protokoly vám poskytujú príklad toho, ako merať zloženie tela a rôzne metabolické parametre u myší pomocou analýzy zloženia tela a systému monitorovania metabolizmu zvierat. Pre obe techniky je nevyhnutné zabezpečiť, aby stroje fungovali optimálne. Za týmto účelom je nevyhnutné, aby výskumný pracovník vykonal test fyzikálneho zloženia pre telesnú analýzu a kalibroval sa na základe známeho zloženia plynu pre systém monitorovania metabolických zvierat. vybavenia. To zaisťuje väčšiu konzistenciu výsledkov a schopnosť identifikovať potenciálne problémy so strojom.
Úpravy a opravy chýb
obmedzenia
Budúce aplikácie
Zatiaľ čo v tomto príspevku sme ako príklad chorobného stavu, pri ktorom je užitočné meranie zloženia tela a metabolických parametrov, použili obezitu získanú prostredníctvom prísunu tukov, použitie týchto prístrojov zďaleka nie je obmedzené na túto oblasť výskumu. Použitie týchto techník je tiež cenné pri štúdiu chorôb, ako je cukrovka, kardiovaskulárne choroby, sarkopénia súvisiaca s vekom, krehkosť, rakovinová kachexia, svalová dystrofia a lipodystrofia. Aj keď sú počiatočné náklady na získanie takejto infraštruktúry značné, schopnosť používať zariadenie vo viacerých a rôznych oblastiach lekárskeho výskumu tieto počiatočné náklady zmierňuje. Priebežné náklady na reagencie a spotrebný materiál pre tieto stroje sú navyše minimálne; Je však potrebné brať do úvahy a počítať s preventívnou údržbou a servisom.
Metódy opísané v tomto článku sa dajú použiť na charakterizáciu zloženia tela a rôznych metabolických parametrov u myší. Tieto opatrenia sa uplatňujú na veľké množstvo výskumných oblastí a poskytujú dôležité informácie na charakterizáciu fenotypu. Údaje z týchto metód môžu tiež poukazovať na základné mechanizmy, ktoré riadia konkrétny metabolický fenotyp. Ďalší vývoj a zdokonalenie týchto technológií umožňuje výskumníkom posunúť svoje objavy k terapeutickým výsledkom.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.