Aspergillus niger in Otomycosis Who are the Men in Black in Otomycosis PDF Free Download
Diplomová práca Aspergillus niger v Otomykóze Kto sú muži v čiernom v Otomykóze? predložil Marcel Schöpfer číslo mat .: 0412267 na získanie akademického titulu doktor medicíny (Dr.med.univ.) na Lekárskej univerzite v Grazi skúšajúci: doc. prof. Priv.-Doz. Ing. Mag. Dr. Walter Buzina, Ústav pre hygienu, mikrobiológiu a environmentálnu medicínu Univ. Prof. Dr. Doris Lang-Loidolt, Univerzitná klinika pre ORL Graz Graz, júl 2011
Čestné vyhlásenie Čestne vyhlasujem, že som túto vedeckú prácu pripravil sám a vykonal som s ňou spojené činnosti. Tiež vyhlasujem, že som nepoužil žiadne iné ako uvedené pomôcky. Dodržal som všetky autorské a zmluvné práva použitých literárnych zdrojov, použil som iba uvedené zdroje a označené pasáže som označil doslovne alebo s ohľadom na obsah ako taký z použitých zdrojov. Podpora poskytovaná počas pracovného procesu vrátane významných mentorských pokynov je špecifikovaná v plnom rozsahu. Táto práca bola predložená v tlačenej a elektronickej podobe a zatiaľ nebola predložená žiadnemu inému skúšobnému orgánu. Graz, júl 2011 (Marcel Schöpfer)
Poďakovanie Rád by som poďakoval všetkým, ktorí mi pomohli pri vykonaní tejto práce: Inštitútu pre hygienu, mikrobiológiu a environmentálnu medicínu a Univerzitným klinikám pre ušné, nosné a krčné lekárstvo v Grazi a Innsbrucku za poskytnutie potrebného vybavenia a materiálu. Doc. Prof. Priv.-Doz. Ing. Mag. Dr. Walter Buzina a Univ.-Prof. DR. Doris Lang-Loidolt za vedecký dozor. Všetkým kolegom, najmä Bettine Heiling, za praktickú podporu. Magister Peter Tschuffer za opravu tejto práce. Mojmu bratovi Patrickovi za grafickú a technickú pomoc. Mojim milujúcim rodičom, Wernerovi a Elfriede, za trpezlivý sprevádzanie a podporu pri štúdiu humánnej medicíny a za umožnenie dôležitej a nenahraditeľnej životnej etapy. K môjmu krstnému otcovi Dr. Helmut Schöpfer, bez ktorého by som nikdy neštudoval medicínu.
Obsah 1. Úvod. 1 1.1 História. 1 1.2 Čo sú otomykózy. 4 1.3 Anatómia a histológia vonkajšieho zvukovodu. 6 1.4 Biológia húb. 9 1.4.1 Klasifikácia a nomenklatúra. 9 1.4.2 Systém D-H-S: klasifikácia medicínsky dôležitých húb. 11 1.4.3 Štruktúra bunky húb. 12 1.4.4 Fyziológia. 14 1.4.5 Životné podmienky a životný štýl medicínsky dôležitých húb. 15 1.4.6 Mykopatie. 17 1.5 Cieľ práce. 18 2. Materiál a metódy. 20 2.1 Pracovné kroky. 20 2.2 Ukážkové materiály. 20 2.3 Kultúrne médiá. 21 2.4 Molekulárna biologická identifikácia. 21 2.4.1 Izolácia DNA. 22 2.4.2 PCR. 22 2.4.3 Sekvenovanie DNA. 25 2.4.4 Sekvenčná analýza a databáza. 26 3. Výsledky. 27 3.1 Morfológia. 27 3.2 Molekulárne biologické výsledky. 31 3.2.1 Izolácia DNA a PCR. 32 3.2.2 Sekvenovanie DNA. 33 3.3 Lekárske záznamy. 57 3.4 Štatistické vyhodnotenie demografických údajov o všetkých pozitívnych hubových nálezoch z ucha (2006 - 2010). 63 4. Diskusia. 67 4.1 Biologická diskusia. 67 4.2 Klinická diskusia. 69 5. Zhrnutie. 74 6. Abstrakt. 76 7. Literatúra. 77 Príloha. 81
Skratky A. d. Aqua distillata, destilovaná voda bp bázový pár ddntp dideoxynukleotid trifosfát dntp deoxynukleotid trifosfát DNA Deoxyribonukleová kyselina, deoxyribonukleová kyselina EDTA etyléndiamíntetraoctová kyselina Eppi 1,5 ml reakčná nádoba EtBr etídium kyselina brómová ETS interná transkribovaná reakcia s odstupom minúty rpms odstredivá sila RT teplota v miestnosti od A. Aspergillus Taq Thermus aquaticus GG pravý zvukovod. pravá ľavá ľavá RNA ribonukleová kyselina bt2a/b tubulínový primér o. B. bez nálezov sp./spp. Druhy/Niekoľko druhov
Tympanická membrána (Membrana tympanica) Tympanická membrána je šľachovitá pokožka medzi vonkajším zvukovodom a bubienkovou dutinou s trojvrstvovou štruktúrou, je to hranica medzi vonkajším a stredným uchom. Aspergillus niger v otomykózach 8
2. Materiál a metódy 2.1 Pracovné kroky Organigram pracovných krokov, ktorým sa budem podrobnejšie venovať ďalej: Aplikácia na etickú komisiu s hlasovaním v prílohe ORL ambulancia + nátery vonkajšieho zvukovodu pomocou tampónov Kultivácia náterov na bakteriologických a mykologických médiách Morfologická identifikácia Očkovanie Molekulárna biologická identifikácia: izolácia DNA po 24 hodinách ITS-PCR TS-sekvenujúci tubulín na presnejšiu diferenciáciu medzi dvoma typmi 2.2 Materiály na vzorky Osoby diagnostikované s infekciou ucha v ambulanciách na ORL klinikách ORL v Grazi a Innsbrucku boli spôsobilé na štúdiu. Potom, čo boli účastníci štúdie informovaní a dostali svoj súhlas, boli stery odobraté z vonkajšieho zvukovodu pomocou tampónov (Copan Sterile Transport Swabs). Aspergillus niger v otomykózach 20
použité len huby. Variácia nekódujúcej oblasti ITS sa používa na rozlíšenie medzi rodmi a populáciami. Pre PCR reakciu sa najskôr pripraví vzorová zmes, v ktorej sú okrem DNA obsiahnuté všetky zložky (pár primérov, štyri nukleotidy, pufor a DNA polymeráza). 18,8 μl z toho sa pipetuje do 0,2 ml reťazcov reakčných nádob a do každého sa pridá 1,2 μl DNA. Pozitívna a negatívna kontrola sú súčasťou každej dávky. Aby sa presne rozlíšilo medzi Aspergillus tubingenisis a Aspergillus foetidus, bol gén tubulínu amplifikovaný a sekvenovaný pomocou primérov bt2a a bt2b. Aspergillus niger v otomykózach 23
3. Výsledky 3.1 Morfológia Kultúry sa najskôr podrobili makroskopickej a mikroskopickej kontrole (obrázky 2-7). Z našej strany nebolo možné rozlišovať. Aspergillus niger v otomykózach 27
Obrázok 2: Kultúra Aspergillus foetidus na Sabouraud Obrázok 3: Aspergillus foetidus mikroskopicky Aspergillus niger v otomykózach 28
Obrázok 4: Kultúra Aspergillus niger na Sabouraud Obrázok 5: Aspergillus niger mikroskopicky Aspergillus niger v otomykózach 29
Obrázok 6: Kultúra Aspergillus tubingensis na Sabouraud Obrázok 7: Aspergillus tubingensis mikroskopicky Aspergillus niger v otomykózach 30
Medzi jednotlivými druhmi Aspergillus sa nezistili významné rozdiely. 3.2 Molekulárne biologické výsledky Pretože medzi čiernym aspergilom neboli makroskopicky ani mikroskopicky viditeľné rozdiely, zamerali sme sa na molekulárnu biologickú identifikáciu pomocou oblasti ITS ribozomálnej DNA, ktorá je variabilná a nekóduje pre mnoho húb, a tubulínový gén. DNA bola izolovaná z našich húb a sekvenčná analýza začala po PCR. Aspergillus niger v otomykózach 31
3.2.1 Izolácia DNA a PCR Prvým kontrolným krokom pre úspešnú PCR bol agarózový gél s našimi produktmi PCR. Čistenie a sekvenovanie sa mohlo začať s tými vzorkami, ktorých pásy boli zreteľne viditeľné. Obrázok 8: Agarózový gél produktov PCR (ITS), zafarbený pomocou EtBr Obrázok 9: Agarózový gél produktov PCR (-Tubulin), zafarbený pomocou EtBr Aspergillus niger v otomykózach 32
3.2.2 Sekvenovanie DNA ITS oblasti Ako referencia boli použité kmene CBS Aspergillus niger (CBS 554,65), Aspergillus foetidus (CBS 56465) a Aspergillus tubingensis (CBS 134,48). Aspergillus niger sa odlíšil od Aspergillus foetidus a Aspergillus tubingensis na základe základných rozdielov v G 56 A, C 109 T, C 514 T (zarovnanie pozri nižšie). Hľadala sa diferenciácia medzi poslednými dvoma na základe génu kódujúceho tubulín. Aspergillus niger v otomykózach 33
3.3 Lekárske záznamy U 15 pacientov boli okrem presnej molekulárnej biologickej identifikácie nálezy plesní spätne porovnané s klinickými nálezmi. Údaje pochádzajú z klinickej komunikačnej a informačnej siete MEDOCS. Aspergillus niger v otomykózach 57
3.4 Štatistické vyhodnotenie demografických údajov o všetkých pozitívnych hubových nálezoch z ucha (2006 - 2010) Štatistické vyhodnotenie všetkých pozitívnych hubových nálezov z ucha v období rokov 2006 až 2010 z mykologického laboratória Ústavu pre hygienu, mikrobiológiu a environmentálnu medicínu ukázalo 425 pozitívnych hubových nálezov z 360 Pacient. Celkovo bolo nájdených 478 húb, čo možno pripísať opakovaným výskytom jednotlivých pacientov a prítomnosti zmiešaných alebo viacnásobných nálezov. Nájdené huby zahŕňali 28 rôznych druhov. V našej analýze sa kandidóza parapsilóza najčastejšie nachádzala v zvukovode, po ktorej nasledoval A. niger sensu lato. (Tabuľka 6, obrázky 10 a 11) Aspergillus niger v otomykózach 63
Tabuľka 6: Spektrum húb (2006 - 2010) Číslo zárodku/názov zárodku% na základe počtu/názvu zárodku Candida parapsilosis 139 29,08% Aspergillus niger 97 20,29% Aspergillus fumigatus 85 17,78% Candida albicans 83 17,36% Aspergillus flavus 23 4,81% Pseudallescheria boydii 7 1,46% Candida glabrata 6 1,26% Candida lusitaniae (Clavispora lusitaniae) 4 0,84% Huby 3 0,63% Scopulariopsis brevicaulis 3 0,63% Aspergillus candidus 3 0,63% Trichophyton mentagrophytes 2 0,42% Candida non-albicans 2 0,42% Candida guilliermondii (Pichia guilliermondii) 2 0,42% Aspergillus sclerotiorum 2 0,42% Sterilné mycélium 1 0,21% Scopulariopsis sp. 1 0,21% Scedosporium apiospermum 1 0,21% Paecilomyces sp. 1 0,21% Microsporum canis 1 0,21% Exophiala dermatitidis 1 0,21% Chrysosporium queenslandicum 1 0,21% Candida utilis 1 0,21% Candida tropicalis 1 0,21% Candida magnoliae 1 0,21% Candida famata 1 0,21% Candida ciferrii (Stephanoascus ciferrii) 1 0,21% Aspergillus terreus 1 0,21% Aspergillus sydowii 1 0,21% Aspergillus sp. 1 0,21% Aspergillus oryzae 1 0,21% Aspergillus glaucus 1 0,21% Spolu 478 100% Aspergillus niger v otomykózach 64
Vláknité huby (n = 233) vs. klíčiace huby (n = 245) (n = 478) Vláknité huby 49% klíčiace huby 51% Obrázok 10: Schéma vláknitých húb vs. klíčiace huby všetkých pozitívnych nálezov plesní (2006 - 2010) Vláknité huby v percentách (n = 233) 10 % 36% 12% 42% Aspergillus niger Aspergillus fumigatus Aspergillus flavus Ostatné Obrázok 11: Schéma vláknitých húb všetkých pozitívnych nálezov plesní (2006 - 2010) Aspergillus niger v otomykózach 65
Pohlavné rozdelenie (n = 360) ženy 43% muži 57% Obrázok 12: Pohlavné rozdelenie pacientov so všetkými pozitívnymi plesňovými nálezmi (2006 - 2010) Muži boli častejšie konfrontovaní s plesňovými nálezmi v uchu. Výsledky však nemožno vysledovať späť k diagnostikovaným otomykózam a poskytujú iba prehľad o hubách nájdených v uchu za posledných päť rokov. Vekové rozdelenie pozitívnych hubových nálezov v% (n = 360) 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 18 18 16 13 13 8 8 3 4 0-10 11-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61 -70 71-80> 80 Obrázok 13: Vekové rozdelenie pacientov so všetkými pozitívnymi plesňovými nálezmi (2006-2010) Priemerný vek bol 52,3 rokov so strednou hodnotou 52 a štandardnou odchýlkou 19,88 rokov. Vekové skupiny 41 až 50-ročných a 51 až 60-ročných (po 18%) boli najčastejšie konfrontované s pozitívnymi plesňovými nálezmi. Aspergillus niger v otomykózach 66
rovnako ako kvasinky boli rovnako prítomné ako jediná prítomnosť Aspergillus niger. Nakoniec sa skontrolovali hubové nálezy (z ucha) za posledných päť rokov v oblasti Grazu. Zo 425 pozitívnych plesňových nálezov a 360 pacientov sme zistili tesnú väčšinu v prospech kvasiniek (51%) v porovnaní s vláknitými hubami (49%). Prevažujúcim izolátom medzi 28 rôznymi druhmi bola Candida parapsilosis (29%), druhou najbežnejšou a teda najbežnejšou plesňou bola Aspergillus niger sensu lato (20%). Priemerný vek bol 52,3 rokov (stredná hodnota: 52) so štandardnou odchýlkou 19,88 rokov. Vekové skupiny 41 až 50-ročných a 51 až 60-ročných (každá 18%) boli najčastejšie konfrontované s pozitívnymi plesňovými nálezmi. Muži (57%) boli konfrontovaní s pozitívnym plesňovým výsledkom častejšie ako ženy (43%). Aspergillus niger v otomykózach 75