Bezbunková syntéza bielkovín
V posledných rokoch viedol výskum genómu k identifikácii veľkého množstva génov z rôznych druhov. K prevažnej časti týchto génových sekvencií však v súčasnosti nemožno priradiť žiadnu definovanú funkciu, pretože kódované proteíny môžu byť reprezentované iba nedostatočne alebo vôbec pomocou bežných metód expresie na báze buniek. Základným predpokladom jasného priradenia a overenia funkcie je dostupnosť správne syntetizovaných a spracovaných proteínov. To má za následok zvyšujúcu sa potrebu efektívnych systémov syntézy proteínov, ktoré sú schopné generovať proteíny najrôznejších štruktúrnych a funkčných tried rovnako kvalitne a kvantitatívne. V tejto súvislosti sa v súčasnosti čoraz častejšie používa metóda bezbunkovej syntézy proteínov, ktorá umožňuje enormné zrýchlenie potrebných pracovných krokov od DNA k proteínu. Bezbunkové proteíny môžu navyše získať nové vlastnosti, ktoré majú zásadný význam pre ďalšie technologické aplikácie.
Začiatky vývoja technológií
Súčasné translačné systémy in vitro
Intenzívny výskum v oblasti syntézy proteínov bez buniek v priebehu vývoja systému viedol k tomu, že boli stanovené obmedzenia prokaryotických a eukaryotických in vitro translačných systémov a boli optimalizované základné parametre. Oblasťami výskumu, na ktorých sa v súčasnosti intenzívne pracuje, je najmä ďalší vývoj translačne aktívnych bunkových lyzátov do vysoko produktívnych systémov, generovanie a optimalizácia špeciálnych matíc DNA a RNA pre rôzne bezbunkové systémy a zdokonalenie riadenia reakcie v novo vyvinutých reaktorových systémoch.
Možnosti bezbunkovej syntézy proteínov sú eukaryotickými in vitro translačnými systémami značne rozšírené, pretože posttranslačné modifikácie ovplyvňujú fyzikálno-chemické vlastnosti proteínov a pre ich funkčnosť majú často zásadný význam. Rozhodujúce výhody bezbunkovej syntézy proteínov, ako je vysoko výkonná syntéza trvale aktívnych alebo cytotoxických membránových proteínov, je teraz možné kombinovať s biočipovými, impedimetrickými a elektrofyziologickými funkčnými analýzami.
Jednou zo základných výhod bezbunkovej syntézy proteínov je možnosť dávkovať lineárne šablóny DNA priamo do otvoreného systému a prepísať kódovanú genetickú informáciu na proteíny bez časovo náročných krokov klonovania. To sa deje v spojených transkripčných/prekladových systémoch. Templáty vyrobené pomocou procesu expresnej PCR obsahujú všetky prvky potrebné na efektívnu syntézu proteínov v prokaryotických aj eukaryotických bezbunkových systémoch a sú voliteľne vybavené sekvenciami, ktoré kódujú rôzne N- alebo C-terminálne afinitné značky. Touto metódou je možné uskutočniť aj pridanie N-koncových signálnych sekvencií, ktoré sú potrebné na zameranie membránových proteínov a sekretovaných proteínov v proteolipozómoch. Expresia PCR je dôležitým nástrojom pre cielené navrhovanie proteínov, pretože touto metódou je možné zaviesť mutácie a syntetizované proteíny je možné modifikovať ich funkčnými vlastnosťami v rámci evolučného procesu a prispôsobiť ich technologickým požiadavkám.
Inkorporácia modifikovaných a umelých aminokyselín, ktoré sa kotranslačne zavádzajú do rastúcich proteínových reťazcov pomocou pre-acylovaných tRNA počas syntézy proteínov, sa uskutočňuje v prokaryotických a eukaryotických systémoch bezbunkovej syntézy proteínov. Konjugáty s definovaným proteínom, najmä membránové a glykoproteínové konjugáty s biotinylovanými alebo fluorescenčnými skupinami, sa syntetizujú týmto spôsobom bez buniek. Ko-translačné, miestne špecifické proteínové značky sú šetrnou metódou, ktorá výrazne zjednodušuje funkčnú charakteristiku produkovaných proteínov. Detekovateľnosť zabudovanej biotinylovanej alebo fluorescenčnej aminokyseliny umožňuje lokalizáciu príslušne označených membránových proteínov v štruktúrach lipidovej membrány, ako aj účinnú detekciu interakcie ligandu. V spojení s expresnou PCR je možné pre skríningové aplikácie rýchlo syntetizovať širokú škálu značených proteínov. Okrem toho sa táto metóda používa na produkciu proteínov vo forme molekulárnych spínačov, ktoré menia svoju fluorescenčnú emisiu v reakcii na externý signál.
Kontaktná osoba:
DR. Štefan Kubick
Fraunhoferov inštitút pre biomedicínske technológie IBMT
Oddelenie bunkovej biotechnológie a biočipov
Skupina bezbunkovej syntézy bielkovín
Telefón: 0331/58187-306
E-mail: [email protected]
Ďalšie informácie:
Vlastnosti tejto tlačovej správy:
Novinári, obchodní zástupcovia, vedci
Biológia, výživa/zdravie/starostlivosť, medicína
nadregionálny
Výskum/prenos poznatkov, výsledky výskumu
Nemecky