Chronický model myši infikovaný salmonelou (preložený do nemčiny)

Zhrnutie

Vytvorte myšací model s chronickou bakteriálnou infekciou s pretrvávajúcou kolonizáciou Salmonella Typhimurium v ​​čreve po dobu 27 týždňov.

Abstrakt

Myší model bakteriálnej infekcie je silným modelom pre štúdium oblastí, ako je infekcia, zápal, imunológia, signálna transdukcia a tumorigenéza. Mnoho vedcov využilo kolitídu vyvolanú Salmonella Typhimurium na štúdium počiatočných štádií zápalu a infekcie. Existuje však iba málo správ o chronickej infekcii in vivo. Myši so stálou existenciou salmonely v gastrointestinálnom trakte nám umožňujú preskúmať dlhodobú interakciu hostiteľa a baktérií, signálnu transdukciu a tumorigenézu. Vytvorili sme myší model chronickej bakteriálnej infekcie s kolonizáciou Salmonella Typhimurium v ​​myšom čreve počas 6 mesiacov. Aby bolo možné tento systém používať, je potrebné, aby sa výskumný pracovník naučil pripravovať bakteriálnu kultúru a plniť sondou zvieratá. Podrobne uvádzame metodológiu prípravy bakteriálnej kultúry a sondy sondou. Ukazujeme tiež, ako Salmonella detekuje perzistenciu v gastrointestinálnom trakte. Tento protokol celkovo pomôže vedcom s myšacím modelom bakteriálnej infekcie zásadne odpovedať na biologické a mikrobiologické otázky.

Protokol

Tento protokol sa skladá z troch častí: bakteriálna kultúra, sondy myší a detekcia salmonely.

1. Podmienka rastu salmonely.

  1. Pripravte doštičku s vývarom Salmonella Luria-Bertani (LB), inkubujte cez noc pri 37 ° C.
  2. Vyberte klon z LB platne a vložte do 7 ml LB do 12 ml skúmavky a pretrepávajte pri teplote 37 ° C asi 5 hodín.
  3. Naočkujte 50 ml LB 0,05 ml stacionárnej fázy kultúry a pri teplote 37 ° C bez trepania asi 18 hodín.
  4. Cez noc sa kultivuje bakteriálna kultúra pri teplote miestnosti pri 6000 otáčkach za minútu po dobu 10 minút, aby sa baktérie suspendovali v HBSS v pomere 100: 3 (LB: HBSS). Napríklad:
    Každých 50 ml LB kultúry sa suspenduje v 1,5 ml HBSS.
  5. V prípade skúmavky na kŕmenie zvierat bakteriálnu kultúru ďalej riedte v pomere 1:10. Napríklad:
    Každá 1,5 ml LB kultúra bude suspendovaná v 15 ml HBSS.

2. Model infekcie salmonelou *.

  1. Pripravte si roztok streptomycínu. Každej myši sa podá 7,5 mg streptomycínu v 100 ul HBSS. Napríklad pripravte celkovo 90 mg streptomycínu v 1,2 ml HBSS pre 10 myší. Pri príprave roztoku streptomycínu vždy o niečo väčší objem.
  2. 4 hodiny pred perorálnym podaním vyberte vodu a jedlo.
  3. Myši sondujte streptomycínom 7,5 mg streptomycínu (100 ul HBSS pre kontrolné myši). Palcom a prostredníkom pevne uchopte kožu cez rameno myši, ukazovákom narovnajte hlavu a krk, aby sa pažerák vyrovnal. Zarovnajte špičku guľky kŕmnej ihly so strechou úst a na pravej strane zadnej časti hrdla, potom ju opatrne vpichnite do pažeráka a vstreknite 100 μl roztoku. Žiadny odpor by nemal byť cítiť.
  4. 20 hodín po ošetrení streptomycínom sa voda a jedlo znova odoberú a potom sa myši infikujú baktériami.
  5. Každú myš ošetrenú 100 μl suspenzie v HBSS alebo sterilným HBSS (kontrola) dajte orálne. Procedúra sondou je rovnaká ako u myší s 2,3) streptomycínom.

* Štúdie na zvieratách sa uskutočňovali s použitím samíc myší C57BL/6 bez patogénov (Taconic, Hudson, NY) vo veku 6 - 7 týždňov, ako je opísané vyššie 1. Protokol bol schválený Výborom pre živočíšne zdroje z University of Rochester University (UCAR).

3. Detekcia salmonely v črevách.

  1. Zhromažďujte výkaly pomocou myši (približne 100 mg).
  2. Preveďte vzorku stolice do 1,5 mikrocentrifugačnej skúmavky s 1 ml PBS a intenzívne vortexujte.
  3. Odstreďujte 10 minút pri 800 otáčkach za minútu. Supernatant preneste do čistej mikrocentrifugačnej skúmavky.
  4. Odstreďovanie pri 6000 ot./min. Počas 5 minút. Supernatant sa vyhodí a k peletám sa pridá 200 ul PBS a vortexuje sa.
  5. 200 μl PBS rozdrvte pomocou jednorazovej trepačky na platňu BBL CHROMagar, aby ste zistili Salmonella. Salmonella sa javí ako fialová (ružová až fialová, pozri obrázok 1). Ak 200 μl poskytne na platni príliš veľa kolónií, na strip použite 100 μl alebo 50 μl.

4. Reprezentatívne výsledky.

Ak je protokol vykonaný správne, kolonizáciu Salmonella typhimurium možno zistiť v myšom čreve dlhšie ako 6 mesiacov. Salmonella sa dala zistiť pomocou fekálnej kultúry počas 6 mesiacov (obr. 1). Ako je typické pre tento model, strata hmotnosti a smrť nastávajú do 4 týždňov od infekcie. V závislosti od kmeňov Salmonella použitých na infekciu niektoré myši nemôžu prežiť viac ako 6 mesiacov.

salmonelou
ilustrácia 1. Črevná Salmonella u druhov Salmonella sa javí ako fialová (ružová až fialová) farby, kvôli metabolickým rozdielom v prítomnosti vybraných chromogénov. Ostatné baktérie sú buď inhibované, alebo vytvárajú modrozelené alebo bezfarebné kolónie.

infikovaný
Obrázok 2. Podiely prežitia myší infikovaných Salmonella mutantom PhoPc, PhoPc Avra- a PhoPc AvrA-/AvrA +, PhoPc Avra ​​po dobu 4 týždňov (28 dní).

stôl 1. Telesná hmotnosť myší infikovaných salmonelou počas 4 týždňov.

0 1 týždeň 2 týždne 3 týždne 4 týždne
kontrola 16,78 ± 1,05 16,91 ± 1,28 18,26 ± 1,23 19,31 ± 1,26 20,26 ± 1,15
PhoP c 16,89 ± 1,03 17,14 ± 1,19 17,43 ± 1,63 * 18,68 ± 1,78 20,05 ± 1,11
PhoP c Avra- 16,91 ± 1,12 16,96 ± 1,39 17,06 ± 2,14 ** 18,71 ± 2,18 20,15 ± 1,56
PhoP c AvrA-/AvrA + 16,94 ± 0,96 17,17 ± 1,02 17,63 ± 1,42 * 18,44 ± 2,03 20,09 ± 1,17

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Diskusia

Aby bolo možné tento systém používať, je potrebné, aby sa výskumný pracovník naučil kŕmiť zvieratá nasogastrickou sondou. Podrobne popisujeme metodológiu prípravy bakteriálnej kultúry a sondy myší. Ukážeme tiež, ako monitorovať perzistenciu salmonely v gastrointestinálnom trakte (GI trakt). Kritické kroky v tomto protokole zahŕňajú:

  1. Predbežná liečba streptomycínom: Predbežná liečba streptomycínom by mohla zbaviť časť komenzálnej črevnej flóry a spôsobiť, že myši budú náchylné na infekciu salmonelou 2.
  2. Napájacia trubica na salmonely: Pre začiatočníkov môže byť napájacia trubica výzvou. V určitom okamihu zlyhá nazogastrická sonda, pretože roztok sa náhodne vstrekne do dýchacích ciest a spôsobí smrť myši.
  3. Pretrvávajúca bakteriálna kolonizácia: je potrebné pozorne sledovať baktérie v gastrointestinálnom trakte. Okrem myšej fekálnej kultúry sa môže obsah slepého čreva použiť aj na detekciu salmonely v doštičkách BBL CHROMagar. Pri usmrtení myší po infekcii salmonelou zozbierajte obsah slepého čreva.

Kolonizáciu salmonelou sme testovali na myšiach v rôznych koncentráciách: 1 x 103 jednotiek tvoriacich kolónie až 1 x 108 jednotiek tvoriacich kolónie (100 μl/myš). 1. októbra 6 - 10 x 108 jednotiek tvoriacich kolónie bola Salmonella schopná kolonizovať myši. Preto na základe našich predchádzajúcich publikácií 1, 5 a nepublikovaných údajov nebude konečná koncentrácia salmonely v tomto roztoku meraná pred kŕmením žalúdočnou sondou.

V tomto experimentálnom postupe máme samice myší C57BL/6 bez patogénov (Taconic, Hudson, NY), ktoré boli staré 6-7 týždňov. Použité bakteriálne kmene zahŕňajú kmeň ATCC14028s divokého typu Salmonella typhimurium (WT-SL), nepatogénny Salmonella mutant PhoP c3, PhoPc Avra ​​a PhoPc AvrA-/AvrA +, PhoPc Avra ​​(tabuľka 2). Pomocou tohto protokolu je možné detegovať kolonizáciu Salmonella typhimurium v ​​myšom čreve po dobu viac ako 6 mesiacov (obr. 1). Infekcia a zápal salmonelou sa merala pozorovaním výkalov a hmotnosti chlapcov. Keď sa odoberali vzorky tkaniva a krv, merala sa dĺžka čreva ako znak zápalu čreva. Skúmali sa tiež hmotnosti sleziny a pečene. Cytokíny myšacieho séra sa testovali pomocou ELISA5. Ďalej sa biochemické a molekulárne metódy ďalej používajú na testovanie zmien zápalových cytokínov a patologických zmien vyvolaných Salmonella 5.

K úbytku hmotnosti a smrti zvyčajne dôjde do 4 týždňov od infekcie (tabuľka 1). Po infekcii Salmonella došlo k významnej strate telesnej hmotnosti v skupinách s bakteriálnou infekciou v porovnaní s kontrolnou skupinou bez bakteriálnej liečby (* infikovaných pc, 78% PhoP c Avra- alebo 70% PhoP c AvrA-/AvrA + môže pretrvávať s Salmonella prežíva v čreve. Po akútnej infekcii všetci pozostalí stále uskutočňovali salmonelu, ktorú bolo možné zistiť po infekcii 6 mesiacov po zákroku popísanom v tomto návrhu. Akonáhle myši prežili 3 týždne po infekcii, myši pribrali na váhe a došlo k menšiemu počtu úmrtí Okrem toho údaje o imunofluroscenčnom farbení tiež ukazujú inváziu salmonely do sliznice čreva 27 týždňov po infekcii (obr. 3). Tieto údaje ukazujú, že PhoPc, PhoPc Avra ​​alebo PhoPc AvrA/AvrA + sa môže použiť pre model chronickej infekcie.

Myši s faktorom rezistencie hostiteľa Nramp1 +/+ sú rezistentné na infekciu Salmonella 3-6. Myši C57/BL6 s NRAMP boli v súčasných štúdiách chybné. Zistili sme, že 90% myší infikovaných patogénnym kmeňom Salmonella 14028s nemôže prežiť dlhšie ako 4 týždne (údaje nie sú uvedené). Pochopiť dlhodobé účinky divokého typu S. Môže sa použiť infekcia tyfimuriom, myši s Nampr1 +/+.

Tento model je zavedený v laboratóriu BSL-2. Náš protokol je schválený Výborom pre živočíšne zdroje University of Rochester University (UCAR). Myši infikované salmonelou pravdepodobne zažijú nepohodlie a stres a stanú sa menej aktívnymi a pomaly sa pohybujúcimi. Ich srsť sa dá štetiť a nie je dovolené ich normálne kŕmiť a piť. Zvieratá budú pozorne sledované a pokiaľ sa u nich prejavia akékoľvek príznaky nepohodlia, ako napríklad nedostatočná pohyblivosť dostatočná na udržanie hydratácie a kalorického príjmu, ak myš javí známky toho, že aspirovala tekutinu alebo významne chudla (10% alebo viac) 7 a neurobila to okamžite myš bola humánne usmrtená. Celý personál laboratória bude vyškolený v pozorovaní myší podľa 8, 9.

Mnoho štúdií predbežnej liečby streptomycínom využilo výhodu kolitídy vyvolanej Salmonella typhimurium pre štúdie o včasnej fáze infekcie 1,2,10. Avšak iba niekoľko z nich uviedlo o chronickej infekcii na myšom modeli in vivo 11. Myši s perzistentnou existenciou Salmonella v gastrointestinálnom trakte nám umožňujú preskúmať dlhodobú interakciu hostiteľ-baktéria, signálnu transdukciu a tumorigenézu. Vytvorili sme myší model chronickej bakteriálnej infekcie s Salmonella typhimurium kolonizujúcim v myšom čreve počas 6 mesiacov. Tento model sa môže použiť aj na patogenézu E. coli a probiotické štúdie. Tento protokol celkovo pomôže výskumníkom so zásadne dôležitým modelom myší odpovedať na biologické a mikrobiologické otázky.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.