Detekcia genómu ľudského metapneumovírusu (hmpv) u hospitalizovaných detí - PDF zadarmo
Detekcia genómu ľudského metapneumovírusu (hmpv) u hospitalizovaných detí Úvodná dizertačná práca zameraná na získanie doktorandského titulu na Vysokej lekárskej fakulte Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Thomas Bernd Glatzel z Bonnu 2008
Pripravené so súhlasom Lekárskej fakulty Univerzity v Bonne 1. Recenzent: Dipl.-Biol. Priv.-Doz. DR. rer. nat. Oliver Schildgen 2. recenzent: Prof. Dr. med. Deň ústnej skúšky Jürgena Rockstroha: 27. októbra 2008 Z Inštitútu lekárskej mikrobiológie, imunológie a parazitológie Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn riaditeľ: Prof. Dr. med. Publikácia Achima Höraufa: Táto dizertačná práca je elektronicky publikovaná na univerzitnom publikačnom serveri ULB http://hss.ulb.uni-bonn.de/diss_online.
Obsah 0 Zoznam skratiek 7 1 Úvod 9 1.1 Paramyxovírusy 9 1.1.1 Klasifikácia 10 1.1.2 Štruktúra 12 1.1.2.1 Vírusové častice 12 1.1.2.2 Genóm a štruktúra genómu 12 1.1.2.3 Vírusové proteíny 14 1.1.3 Replikácia 16 1.1.4 Vírusy parainfluenzy 17 1.1.5 Vírus mumpsu 19 1.1.6 Vírus osýpok 20 1.1.7 Respiračný syncyciálny vírus (RSV) 23 1.1.8 Ľudský metapneumovírus (hmpv) 25 1.2 Cieľ práce 29 2 Materiál a metódy 30 2.1 Materiál 30 2.1.1 Zariadenie 30 2.1.2 Chemikálie 31 2.1 .3 Médiá 32 2.1.4 Bunkové kultúry 33 2.1.5 Zásobné roztoky 33 2.1.6 Pufre 34 2.1.7 Rýchle testy 34 2.1.8 Systémy reagencií 35 2.1.9 Enzýmy 35 2.1.10 Nukleotidy 35 2.1.11 Priméry 35 2.1.12 Štandard veľkosti DNA 36 5
2.1.13 Plazmidy 36 2.1.14 Vzorky 36 2.2 Metódy 37 2.2.1 Bunková kultúra 37 2.2.2 Extrakcia RNA zo supernatantu bunkovej kultúry pomocou súpravy RNeasy Protect Mini Kit 38 2.2.3 Polymerázová reťazová reakcia (PCR) 40 2.2.4 Gélová elektroforéza 45 2.2.5 Čistenie PCR amplifikáty pomocou QIAquick-PCR purifikačnej súpravy 46 2.2.6 Klonovanie PCR amplifikátov pomocou TOPO TA klonovacej súpravy 47 2.2.7 Sekvenovanie rekombinantných plazmidov 50 3 Výsledky 52 3.1 RNA-neskorší pufor 52 3.2 Bunková kultúra 53 3.3 Optimalizácia PCR 53 3.4 infekcie hmpv a RSV 54 3,5 Vekové rozdelenie 55 3,6 Sezónny priebeh 56 3,7 Príznaky a diagnostika 57 3,8 Koinfekcie 57 3,9 Prípady 58 3,10 Hmpv a zápal stredného ucha 65 4 Diskusia 67 5 Zhrnutie 71 6 Bibliografia 72 7 Poďakovanie 88 6
0 Zoznam skratiek: APV Avian Pneumovirus CMV CPE CRP CT Cytomegália Virus Cytopatický účinok C-reaktívny proteín Počítačový tomogram DNA dntps Deoxyribonukleová kyselina Deoxyribonukleozid trifosfáty E. coli Escherichia coli EDTA Kyselina etyléndiamíntetraoctová EEG Enzymový imunogram EKorbetet. a ďalšie sérum fetálneho teľaťa FCS GCS stupnica kómy v Glasgowe HBV HCV HHV hmpv HSV vírus hepatitídy B vírus hepatitídy C vírus ľudský herpes vírus ľudský metapneumovírus herpes simplex vírus kb kd Kilobázy Kilodalton 7
LB mm mrna MRT Luria-Bertani Millimolar messenger-ribonukleová kyselina Magnetická rezonančný tomogram ND nm NS neuskutočnené Nanometer Neštrukturálny proteín PBS PCR Fosfátom pufrovaný soľný roztok Polymerázová reťazová reakcia SDS SSPE Dodecylsulfát sodný Subakútna sklerotizujúca panencefalitída RNA rpm RS Vírusový vírus ribcytosteru minútu Cievny µg
Paramyxovírusy sa vyznačujú nasledujúcimi piatimi vlastnosťami: 1. Majú negatívne orientovanú jednovláknovú RNA, ktorá sa nachádza výlučne v špirálovitom nukleokapside rezistentnom na RNAse, ktorý tiež obsahuje vírusovú polymerázu. 2. Prepis sa vykonáva v typickom režime stop-restart. 3. Vírusová replikácia prebieha v cytoplazme. 4. Vírusové častice vyžadujú lipidový obal na cieľové bunky, aby sa tam naviazali. 5. Vírus preniká do bunky prostredníctvom fúzie vírusovej membrány s bunkovou membránou (Collins et al., 2001). 1.1.1 Klasifikácia Paramyxovírusy sa delia na dve podrodiny: paramyxo- a pneumoviriny. Ďalšie rozdelenie na rody a niektorých charakteristických zástupcov je uvedené v tabuľke 1. 10
Podčeľaď Rod Ľudské zviera Paramyxovirinae Respirovírus Parainfluenzavírus typu 1 a 3 Hovädzí parainfluenza vírus typu 3, Sendaivirus Rubulavirus Mumps Virus, Parainfluenza Virus typy 2 a 4a, b Psí parainfluenza vírus Typ 2, Avulavirus Newcastle virus Virus, Morbillivirus Muscle, Virus -Petici- Prežúvavci-Virus Henipavírus Hendravirus Nipahvirus Hendra Nipah Menangle Pneumovirinae Pneumovirus Respiračný hovädzí syncyciálny vírus (RS- Respiračný vírus) Syncytialvirus, Pneumoniavirus myši Metapneumovírus Ľudská rinotracheitída Virus Ľudská rinotracheitída Medzinárodný výbor pre taxonómiu pre vírusy v roku 2000 11
2 Materiál a metódy 2.1 Materiál 2.1.1 Vybavenie inkubátora: inkubátor s plynným CO 2, Heraeus, inkubátor Hanau C200, Labotect, komory pre elektroforézu Meckenheim: Model B1, PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen Model 41-1825, PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen Schüttler: Certomat S, Sartorius BBI Systems International GmbH Rocking Platform, Biometra GmbH, Göttingen Sequencer: 3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems, Darmstadt Napäťové zariadenia: Napájací model 500/200, Bio-Rad Laboratories, Mníchovský napájací model 250/2,5, Bio-Rad Laboratories, Munich Sterilné lavice: Herasafe, Heraeus Instruments, Hanau STERIL-ANTARES, Biohit Deutschland GmbH, Rosbach Thermocycler: Mastercycler gradient, Eppendorf, Hamburg T3 Thermocycler, Biometra GmbH, Göttingen Vortexer: Vortex-Genie2, Fisher Scientific GmbH, Schwerte Waage: PM 1200, Mettler Toldedo GmbH, Švajčiarsko Vodný kúpeľ: GFL 1038, Gesellschaft für Labortechnik mbh, Centrifúgy Burgwedel: Biofuge 13, Heraeus Instruments, Hanau Cent puška 5415 C/5417 C, Eppendorf AG, Hamburg Megafuge 1.0, Heraeus Instruments, Hanau MULTIFUGE L-R, Heraeus Instruments, Hanau TDX Centrifuge TM, Abbott Diagnostica, Wiesbaden UJ II KS, Heraeus Instruments, Hanau 30
2.1.2 Chemikálie Spoločnosti, ktorých chemikálie boli použité, sú: Agaróza Ampuwa Bacto-agar Bacto-Tryptón Bacto kvasnicový extrakt Kyselina boritá Bromofenol Blue Eagle s-minimum Základné médium EDTA Etanol Ethidium bromid Fetálne teľacie sérum Chlorid draselný Hydrogénfosforečnan draselný Chlorid sodný dihydrogenfosforečnan sodný Roztok trypsín/EDTA SeaPlaque GTG Agarose, Cambrex Bio Science Rockland, Inc.; Biozym Seakem LE Agarose, Biozym, Oldendorf NuSieve GTG Agarose, Biozym, Oldendorf Fresenius Kabi, Bad Homburg Difco, Detroit, USA Difco, Detroit, USA Difco, Detroit, USA Merck KGaA, Darmstadt Serva, Heidelberg Biochrom AG, Berlin Merck KGaA Darmstadt Merck KGaA Darmstadt Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Biochrom, Berlin Merck KGaA, Darmstadt Merck KGaA, Darmstadt Merck KGaA, Darmstadt Merck KGaA, Darmstadt Merck KGaA, Darmstadt Biochrom AG, Berlín 31
2.1.3 Médiá Eagle s minimom Esenciálne médium Eagle s-mem-ucho NaHCO 3 Pridanie: Glutamín Penicilín G Streptomycín Fetálne teľacie sérum Biochrom AG, Berlín 2,2 g/l 280 µg/l 40 U/ml 50 µg/l 10% (obj./obj.) Luria Bertani médium (LB médium) s extraktom kvasiniek Ampicillin Bacto 2,5 g Bacto-Tryptone 5 g NaCl 2,5 g Aqua dest. do 500 ml Táto zmes bola autoklávovaná 20 minút, skladovaná v chladničke pri 4 ° C a pred naočkovaním bolo pridané 50 ug ampicilínu. Doštičky s agarom Luria Bertani (doštičky s agarom LB) s ampicilínovým kvasnicovým extraktom 2,5 g Bacto tryptónu 5 g NaCl 2,5 g Bacto agaru 6,25 g destilovanej vody. do 500 ml Táto zmes sa autoklávovala 20 minút, potom čo sa médium ochladilo, sa pridalo 50 ug ampicilínu a 20 až 30 ml sa vložilo do Petriho misky (Ø: 10 cm) a potom sa uložilo pri 4 ° C v chladničke. 32
SOC médium (6 ml) tryptón 2% kvasnicový extrakt 0,5% NaCl 10 mm KCl 2,5 mm MgCl2 10 mm MgSO 4 10 mm glukóza 20 mm 2.1.4 Bunkové kultúry Vero-B4 bunky ATCC-ACC-33 LLC -MK2 bunky ATCC-CCL7 MS bunky, ktoré nie sú uvedené v ATCC MDCK bunky ATCC-CLL-34 RD bunky A-204; ATCC-ACC-250 2.1.5 Zásobné roztoky Ampicilín 50 mg/ml (H20) EDTA (0,5 M) EDTA Aqua dest. titrovaná na pH 8 NaOH, autoklávovaná 186,1 g na 1 000 ml etídiumbromidu 10 mg/ml 33
Fosfátom pufrovaný soľný roztok (PBS) NaCl KCl Na2 HPO4 KH2P04 Aqua dest. pH titrované na 7,4 HCl, autoklávované 8 g 0,2 g 1,44 g 0,24 g na 1 000 ml 2.1.6 Tlmivý roztok Tris-borát-EDTA tlmivý roztok (TBE tlmivý roztok 5x) Tris-bázická kyselina boritá EDTA ( 0,5 M) H 2 O 54 g 27,5 g 20 ml a 1000 ml 2.1.7 Rýchle testy Rýchly test RSV Chrípkový rýchly test RSV testovacia súprava, Directigen, Sparks USA Testovacia súprava na chrípku A + B, Directigen, Sparks USA Pomocou týchto rýchlych testov každá vzorka od pacientov s infekciou horných a dolných dýchacích ciest bola testovaná na chrípku a RSV. Výsledky týchto testov boli zapracované do časti s výsledkami tejto práce. 34
8 reagenčných systémov BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit Applied Biosystems, Foster City USA Expand High Fidelity PCR System Roche Diagnostics GmbH, Mannheim HiSpeed Midi Qiagen GmbH, Hilden, HiSpeed Maxi Qiagen GmbH, Hilden, Nemecko One Step RT-PCR Kit Qiagen GmbH, Hilden, Nemecko QIAprep Spin Miniprep Qiagen GmbH, Hilden, Nemecko QIAquick-PCR-Purification Kit Qiagen GmbH, Hilden, Nemecko RNeasy Protect Mini Kit Qiagen GmbH, Hilden, Nemecko Topo-TA Cloning Kit Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Nemecko 2.1.9 Enzýmové reštrikčné enzýmy EcoR1 Biolabs, Schwalbach, Nemecko DNA polymeráza Thermus aquaticus DNA polymeráza Roche Applied Science, Mannheim, Nemecko Thermus aquaticus DNA polymeráza Qiagen GmbH, Hilden, Nemecko Reverzná transkriptáza Omniscript, Sensiskript Reverzná transkriptáza Qiagen GmbH, Hilden, Nemecko 2.1.10 Nukleotidy deoxyadenozíntrifosfát ( 25 nm) deoxytymidín trifosfát (25 nm) deoxycytozín trifosfát (25 nm) deoxyguanozín fosfát (25 nm) Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nemecko 2.1.11 Priméry Štyri priméry boli založené na publikácii Viazov et al. (2003). Ich sekvencie preto zodpovedajú oblasti N génu. 35
Všetky priméry použité pre túto prácu boli vyrobené spoločnosťou Sigma, Deisenhoven. Sekvencie, ktoré nasledujú, sú zaznamenané v smere 5 3. 111s AGAGTCTCAGTACACAATMAAAAGAG 705as TGCTTTGCTGCCTGTAGATGATGAG 114s AGAGTCTCAGTACACAATMAAAAGRGATG 442as GCCATTGTTTTYCTTGCYTC 2.1.12 DNA-standard 1Kb Plus DNA-Marker, Mannheim, Mannheim, Mannheim Fakultnej detskej nemocnice Bonn od 1. októbra 2001 do 31. marca 2004 1. októbra 2001 30. septembra 2002 n = 5 (nezahrnuté do štúdie) 1. októbra 2002 31. marca 2003 n = 300 1. októbra 2003 31. marca 2004 n = 332 n spolu = 632 36
Cieľová sekvencia 1. Separácia vlákien zahrievaním na 95 ° C 2. Hybridizácia s primérmi ochladením na 54 ° C 3. Syntéza DNA predĺžením primerov pri 72 ° C Obrázok 2 Cyklus PCR Na zvýšenie cieľovej sekvencie - tu sfarbená modro - Dvojitá špirála sa roztavila do dvoch jednoduchých vlákien zahrievaním na 95 ° C. Aby bolo možné zahájiť syntézu DNA, musia sa najskôr pripojiť priméry komplementárne k cieľovej sekvencii. K tomu dôjde, keď sa reakčná zmes ochladí na teplotu 54 ° C. Potom, počínajúc od primérov, DNA polymeráza syntetizuje komplementárne vlákna k jednotlivým reťazcom východiskovej DNA. Tento reakčný krok sa uskutočňuje pri 72 ° C. Tieto kroky sa opakujú niekoľkokrát a množstvo DNA sa exponenciálne zvyšuje. 41
Vnorená PCR Vnorená PCR nasleduje po klasickej PCR. Po replikácii väčšej časti DNA, ktorá obsahuje cieľovú DNA, sa táto časť použije ako šablóna pre vnorenú PCR, v ktorej sa replikuje menšia časť, ktorá obsahuje aj cieľovú DNA (pozri obr. 3.2). Tento postup umožňuje zvýšiť citlivosť a špecificitu PCR. V tejto práci bol pre vnorenú PCR použitý systém Roche Expand High Fidelity PCR. Prvý okrúhly primer Cieľová DNA Prvý okrúhly primer Druhý okrúhly primér Prvý prepis Druhý okrúhly primer Špecifický amplikón cieľovej DNA Obrázok 3 Vnorená PCR Horná časť obrázka zobrazuje PCR (pozri vyššie). Druhá časť zobrazuje skutočnú vnorenú PCR. Priméry označené sekundárnymi primérmi sú priméry nested PCR. Sú bližšie k cieľovej DNA ako primery prvého kola. Špecifické segmenty DNA sa tu tiež amplifikujú pomocou reakčných krokov opísaných vyššie pre PCR. 42
52 C 30 sekčné žíhanie 72 C 1 min. Predĺženie Po týchto cykloch došlo k terminálnemu predĺženiu pri 72 ° C po dobu 5 minút. Po ukončení tohto procesu sa dávky skladovali pri 4 ° C až do ďalšieho použitia. Reakčný prístup vnorenej PCR pre hmpv Pre vnorenú PCR sa použil systém Expand High Fidelity PCR System od Roche v Mannheime. 10-násobný tlmivý roztok pre PCR 5 ul dntps (100 mm) 3 ul zmesi enzýmov 1 ul 114s primeru (25 pmol/ul) 0,5 ul 442as priméru (25 pmol/ul) 0,5 ul MgCl2 (25 mm) 1 ul Voda bez RNAzy 34 ul templátu 5 ul 50 ul protokolu vnorenej PCR Po počiatočnej denaturácii pri 94 ° C po dobu 2 minút sa uskutočnil nasledujúci cyklus 40-krát: 94 ° C 30 s denaturácia 53 ° 30 s žíhanie 72 ° 45 s predĺženie Potom nasledovala ďalšia koncovka Predĺženie pri 72 ° C po dobu 5 minút a skladovanie v cyklovači a v chladničke pri 4 ° C. Série riedenia na optimalizáciu vnorenej PCR s prídavkom horčíka Na rozdiel od Viazova a kol. (2003) navrhol protokol PCR, do vnorenej PCR bol pridaný horčík na stabilizáciu v tejto práci. 44
35,00% 30,00% 25,00% 20,00% 15,00% 10,00% 5,00% 0,00% 30,40% 26,70% 28,60% 22% 18% 13. 70% 4,30% 3,60% 3,95% 2002/2003 sezóna 2003/2004 sezóna spolu hmpv RSV hmpv + rsv Tabuľka 6 Percentuálne podiely RSV a hmpv alebo zdvojených infekcií od obdobia 01.10.2002 do 31.03. 2003 (sezóna 2002/2003), 1. októbra 2003 až 31. marca 2004 (sezóna 2003/2004) a za celé obdobie (celkovo), na základe celkového kolektívu 300 alebo 332 pacientov zo spomínaných období. 3.5 Vekové rozdelenie Vekové rozdelenie infekcií hmpv malo za následok nasledujúce rozdelenie: novorodenci (vo veku 4 týždňov) n = 0 (0%), 5 týždňov - 5 mesiacov n = 16 (14,03%), 6 - 12 mesiacov n = 20 ( 17,54%), 13 - 24 mesiacov n = 21 (18,42%),> 24 mesiacov n = 31 (27,19%). Viac ako polovica pacientov infikovaných hmpv bola preto staršia ako 12 mesiacov a viac ako tretina pacientov bola staršia ako 24 mesiacov. Vek nebol známy u 26 pacientov (22,8%). Vekové rozdelenie údajov je uvedené v tabuľke 7. 55
22,80% 27,19% 0% 14,03% 18,42% 17,54% do 4 týždňov 5 týždňov - 5 mesiacov 6 - 12 mesiacov 13 - 24 mesiacov počas 24 mesiacov neznáme Tabuľka 7 Percentuálne rozdelenie veku pacientov s hmpv -infekcia v období od 1. októbra 2002 do 31. marca 2004. 3.6 Sezónny priebeh Obrázok uvedený v tabuľke 8 vyústil do sezónneho rozloženia infekcií hmpv. Neexistuje jednoznačná sezónna akumulácia na prelome rokov 2002/2003, zatiaľ čo v sezóne 2003/2004 bolo jasné maximum v januári. 30 25 20 15 10 5 0 hmpv 02/03 hmpv 03/04 október november december január február marec apríl Tabuľka 8 Sezónny trend počtu prípadov hmpv v zimných obdobiach 2002/2003 a 2003/2004 56
A Obrázok 9 B T1-vážený axiálny MRI obraz (A), koronálny FLAIR (fluidne zoslabené inverzné zotavenie) (B) 14-mesačného pacienta s dôkazom hmpv. Významné zvýšenie signálu kortikálne a subkortikálne; interpretované ako lézie v kontexte encefalitídy (Schildgen et al. 2005). Poskytuje rádiologická klinika univerzity v Bonne. Obrázok 10 CT snímky toho istého pacienta 2 dni po MRI. Hypodenzné oblasti; interpretované ako znak všeobecného edému mozgu (dužina a kôra). Hyperhustá akumulácia v arachnoidnom priestore, ktorá sa zatiaľ na MRI nepozorovala (Schildgen et al. 2005). Poskytuje rádiologická klinika univerzity v Bonne 61