Diéta s vysokým obsahom tukov a vysokovýkonný triacylglyceridový test v Drosophila Melanogaster
Zhrnutie
Toto je protokol stravovania s vysokým obsahom tukov používaný na vyvolanie obezity v Drosophile, model na pochopenie základných molekulárnych mechanizmov implikovaných v lipotoxicite. Ponúka tiež vysoko výkonný triacylglyceridový test na meranie akumulácie tuku v Drosophile a prípadne v ďalších (hmyzích) modeloch za rôznych stravovacích, environmentálnych, genetických alebo fyziologických podmienok.
Abstrakt
Srdcové choroby sú hlavnou príčinou úmrtí ľudí na celom svete. Početné štúdie preukázali silné väzby medzi obezitou a srdcovými poruchami u ľudí, na lepšie objasnenie mechanizmov je však potrebných viac nástrojov a výskumov. Už viac ako jedno storočie slúži geneticky veľmi poslušný model Drosophily pri objavovaní kľúčových génov a molekulárnych signálnych dráh, o ktorých sa preukázalo, že sú vysoko konzervované aj za hranicami druhov. Mnoho biologických procesov a mechanizmov chorôb je funkčne chránených za letu, ako je vývoj (napr. Telesný plán, srdce), rakovina a neurodegeneratívne ochorenie. Štúdia obezity a sekundárnych chorôb, ako sú srdcovo-cievne ochorenia, v nedávnom období zohrala veľmi dôležitú úlohu pri identifikácii hlavných regulátorov podieľajúcich sa na metabolickom syndróme u ľudí.
Tu navrhujeme použiť tento modelový organizmus ako účinný nástroj na vyvolanie obezity, t.j. tj. použite nadmernú akumuláciu tuku a vytvorte efektívny protokol na sledovanie obsahu tuku vo forme akumulácie TAG. Okrem vysoko konzervovaného, ale menej zložitého genómu má muška aj krátku životnosť pre rýchle experimenty v kombinácii s ekonomikou. Tento článok poskytuje podrobný protokol pre stravu s vysokým obsahom tukov (HFD) v krmive Drosophila, obezitu a test s vysokou priepustnosťou triacylglyceridov (TAG) na meranie súvisiaceho zvýšenia obsahu tuku s cieľom vyvolať vysoko reprodukovateľný a efektívny pre veľké genetický alebo chemický skríning. Tieto protokoly ponúkajú nové príležitosti na efektívne preskúmanie regulačných mechanizmov zapojených do obezity a poskytujú štandardizovanú platformu pre výskum objavu liekov na rýchle hodnotenie účinkov kandidátov na lieky na rozvoj alebo prevenciu obezity, cukrovky a metabolických chorôb.
Úvod
Samotná potravina HFD pozostáva zo štandardného krmiva pre mušky doplneného o kokosový olej. Pozostáva predovšetkým z nasýtených tukov, o ktorých je známe, že sú spojené s metabolickým syndrómom 18. Zatiaľ čo obezita u cicavčích modelov, ako sú hlodavce, môže trvať indukčné mesiace 19, 20, náš optimalizovaný protokol HFD v krmive Drosophila účinne a reprodukovateľne zvýšil obsah tuku v organizme za niekoľko dní 12, 14. Tento protokol v spojení s vysoko výkonným testom TAG umožňuje efektívny hromadný skríning účinkov genetických faktorov, vplyvov prostredia a kandidátov na liečivá s cieľom objaviť nové modulátory metabolizmu lipidov. Vo výsledku by tieto protokoly mali porozumieť ľudským chorobám súvisiacim s nadváhou a obezitou alebo s nimi bojovať.
Protokol výživy je všestranný a je možné ho použiť na štúdium metabolických a funkčných účinkov akejkoľvek nasýtenej alebo nenasýtenej mastnej kyseliny. Použitie vysoko výkonných testov TAG sa neobmedzuje iba na D. melanogaster, ale je možné ho prispôsobiť množstvu malých modelových organizmov s kutikulami alebo tvrdými extracelulárnymi matricami (napr. Iné druhy Drosophila, C. elegans a iné modelové bezstavovce). merať za rôznych ekologických, genetických a fyziologických podmienok v ktoromkoľvek štádiu vývoja, dospelosti alebo v štádiu metabolického ochorenia. Stanovenie TAG je založené na kolorimetrickom meraní série enzymatických reakcií, ktoré rozkladajú TAG na voľné mastné kyseliny, glycerol, glycerol-3-fosfát a nakoniec H2O2, ktoré sa pripravuje zo 4-aminoantipyrínu (4-AAP) a 3,5- Dichlór-2-hydroxybenzénsulfonát (3,5 DHBS) reaguje za vzniku červeno sfarbeného produktu, ktorý sa meria 96-jamkovým spektrofotometrom.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Protokol
1. Protokol podávania HFD
Táto tabuľka sumarizuje rôzne prísady použité na prípravu našej kontroly. Po vytvorení sa 10 ml potravy naleje do injekčných liekoviek, ochladí sa a uskladní pri 4 ° C na dlhodobé skladovanie.
ilustrácia 1 . Kŕmenie HFD v Drosophile.
Schéma zobrazuje rôzne kroky kŕmenia múch na kontrolnej potravine (normálna strava bez pridania kokosového oleja NF) alebo HFD (s pridaním kokosového oleja). Celý proces trvá 10 dní po prvom odbere dospelých. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Reprezentatívne výsledky
V prípade D. Melanogaster, rovnako ako v prípade iných druhov, dochádza k sexuálnemu dimorfizmu medzi mužmi a ženami 22. Je známe, že ženy sú väčšie a majú viac tuku v bruchu ako muži 22. Na testovanie účinnosti nášho protokolu sme pomocou testov TAG stanovili rozdiely v obsahu TAG medzi mužskými a ženskými štandardnými laboratórnymi muškami štandardného typu (w 1118). Údaje ukazujú, že ženy majú viac tuku v tele ako ich náprotivky (obrázok 2A, B). Údaje tiež ukázali, že testy sú stabilné, bez akýchkoľvek zmien v kvantifikácii TAG v čase (do 50 minút po inkubácii) a bez fluktuácií v závislosti od veľkosti biologickej vzorky (3 alebo 5 múch).
Ukázalo sa, že konzumácia HFD spôsobuje obezitu u ľudí a myší 19, 20, 23. Na testovanie účinnosti nášho protokolu kŕmenia sme použili testy TAG s našimi HFD a kontrolne kŕmené mušky. Zistili sme, že konzumácia HFD v prípravku Drosophila spôsobila zvýšený obsah tuku, ktorý sa časom postupne hromadil (obrázok 3A-C). Ďalším dôležitým zistením je, že už po 18 hodinách podávania HFD (obr. 3C.) sa nám podarilo u týchto múch vyvolať výrazné zvýšenie obsahu tuku. Tieto výsledky naznačujú, že tento systém genetického modelu je ideálnym nástrojom na urýchlený výskum s cieľom nájsť nové regulátory obezity vyvolanej HFD.
Obrázok 2 . TAG testy na mužských a ženských muškách.
2-týždňové mušky na normálnej strave sa zhromaždili, rozdelili podľa pohlavia (muži a ženy), zvážili a zomleli (3 alebo 5 múch na jamku) na analýzu TAG. Testy TAG sa uskutočňovali podľa postupov opísaných v tomto dokumente. Absorbancia každej vzorky pri 550 nm sa odčítala v rôznych časových bodoch (0 min., 5 min., 20 min. A 50 min.), Aby sa určili akékoľvek výkyvy v kvantifikácii TAG, čítanie v priebehu času, kolísanie obsahu tuku v rôznych veľkostiach populácie (3 a 5 mušiek) w 1118 múch a rozdiely medzi mužským a ženským obsahom TAG. Výsledky ukázali, že ženy mali viac tuku ako ich mužské náprotivky (A.-B.) sa hromadia, merania TAG nekolísajú do 50 minút po inkubácii reakcie pri 37 ° C (A.-B.). Aj priemerné hladiny TAG zostávajú medzi testami TAG s 3 alebo 5 muškami nezmenené (A.-B.). Údaje sú uvedené ako priemer ± štatistika SEM: žiadny významný rozdiel. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.
Obrázok 3 . Ovplyvnenie akumulácie tuku HFD.Od: Zhromaždili sa 2-týždňové mušky, ktoré sa zvýšili na normálnu hladinu alebo na hladinu HFD po dobu 5 dní, a stanovili sa tuky pomocou TAG. Obsah TAG bol buď vážený (A.) alebo hladinu bielkovín (B.) normalizované. Údaje ukázali, že konzumácia HFD vedie k zvýšeniu hladín tukov pri obidvoch metódach normalizácie. C: Obsah TAG sa vyšetruje u dvojtýždňových mušiek na normálnom/kontrolnom krmive (NF) a 18 hodín, 1 deň alebo 2 dni na HFD. Výsledky ukazujú výrazné a progresívne zvyšovanie hladín TAG od 18 h do 2 dní vystavenia HFD. Údaje sú uvedené ako priemer ± SEM štatistika: Studentov t-test. * p Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Diskusia
Indukcia obezity u myší môže trvať 19, 20 mesiacov. U múch tento protokol kŕmenia HFD umožňuje vyvolanie akumulácie nadbytočného tuku za niekoľko dní alebo menej, čo spôsobuje zvýšenie akumulácie tuku až po 18:00 (pozri obrázok 2)). HFD kŕmenie opísaným protokolom zvyšuje alebo znižuje obsah glukózy 12, Bmm lipázy a expresiu PGC-1 24. To je v kontraste s dospelým nalačno Drosophila, ktorý spôsobil rýchly pokles obsahu tuku a glukózy 25, 26 a zvýšenú expresiu Bmm 24. Zvyšuje tiež hladiny Bmm alebo PGC-1, aby chránila HFD-indukovanú obezitu 14, 24. Aj keď sa v tomto protokole použilo 30% HFD, lietajte s 3%, 7% alebo 15% obezitou vyvolanou kŕmením tukom v režime 12 závislom od dávky, ako je predĺženie trvania kŕmenia HFD (obrázok 3)). Tiež sme zistili, že jednotlivé mastné kyseliny boli hlavnými zložkami kokosového oleja, t.j. 14% kyseliny laurovej alebo 5% kyseliny myristovej, spôsobuje významne zvýšenú akumuláciu tukov 12 .
Zrýchlená metabolická odpoveď s týmito muchami na terapiu HFD koreluje so zníženou životnosťou 27, ako sa pozoruje u cicavcov 28, ale pozoruje sa, že> 80% mušiek prežíva posledných 20 dní na HFD 27. Rýchla indukcia akumulácie tuku sprostredkovaná konzervovanými bunkovými a molekulárnymi procesmi metabolizmu lipidov a glukózy je prospešná pre mnoho štúdií obezity, ako napríklad: B. Diabetická alebo lipotoxická kardiomyopatia 10, 12, 13, 14, 15, 16. Dôležitý pohľad na dôsledky metabolickej nerovnováhy a súvisiacej srdcovej dysfunkcie pravdepodobne umožní komparatívne translačné štúdie u ľudí.
Protokol výživy HFD je kompatibilný na použitie s inými druhmi a modelmi hmyzu Drosophila, ktoré zdieľajú podobnú stravu s D. melanogasters. Tieto protokoly výživy HFD by sa mohli zodpovedajúcim spôsobom prispôsobiť pre organizmy ako C. elegans alebo dokonca pre iný hmyz, ktorý vyžaduje iné „normálne“ potravinové médiá. 30% HFD nie je vhodný na použitie v experimentoch vyžadujúcich vysoké teploty; Nižšie koncentrácie kokosového oleja alebo jednotlivých mastných kyselín však môžu byť adekvátnymi alternatívami 12 .
Obezita, metabolický syndróm a súvisiace choroby sú vždy na vrchole s katastrofickými účinkami na ľudské zdravie 1, 2. Kombinovaný protokol HFD a vysokovýkonný test TAG poskytujú jedinečnú platformu na použitie modelových organizmov, ako je Drosophila, na rýchlu indukciu obezity a skríning genetických faktorov alebo použitie prírodných a syntetických chemických zlúčenín na lepšie pochopenie metabolickej nerovnováhy. To by v konečnom dôsledku mohlo významne prispieť k rozšíreniu vedeckých poznatkov o vývoji nových liečebných metód alebo liekov na metabolické choroby.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.