Diferenciácia a spoločnosť Proliferati Max Planck
Oddelenie pre vývoj a prestavbu srdca (prof. Dr. Dr. Thomas Braun)
MPI pre výskum srdca a pľúc, Bad Nauheim
(1) Diferenciácia a proliferácia buniek počas vývoja a regenerácie
Molekulárna kontrola diferenciácie a regenerácie v poškodenom a starnúcom srdci
Podľa všeobecnej doktríny sa srdce dospelých skladá z diferencovaných kardiomyocytov (buniek srdcového svalu), ktoré už nie sú schopné deliť sa. Pretože ľudské srdce môže pracovať nepretržite a efektívne po celé desaťročia, predpokladalo sa, že jednotlivé kardiomyocyty tiež prežijú toto obdobie bez väčších zmien. Rôzne štúdie však preukázali, že starnutie a poškodenie srdca nevyhnutne vedú k strate buniek takzvanou programovanou smrťou buniek (apoptóza) s následnými zmenami tkanív (nekróza). Z toho možno vyvodiť záver, že dospelé kardiomyocyty majú stále zvyškovú kapacitu na sebaobnovu a že je to nevyhnutné pre udržanie normálnej činnosti srdca. Doteraz nie je známe, ktoré signály a procesy určujú rovnováhu medzi bunkovou smrťou, prežitím a bunkovým delením.
Pracovná skupina MPI pre výskum srdca a pľúc v Bad Nauheim hľadá rastové faktory, ktoré by mohli túto krehkú rovnováhu riadiť. Jedným z týchto faktorov je pravdepodobne BMP-10, nový člen rodiny BMP (kostné morfogenetické proteíny), ktorý je špecificky exprimovaný v svaloch nazývaných „trabeculae“ v srdcovom tkanive a v predsieni vyvíjajúceho sa myšieho srdca. U homozygotných mutantných myší BMP-10 sa vyvinie skorá dysfunkcia srdca, ktorá môže byť spôsobená najmä nedostatkom trabekulácie, ktorá vedie k úmrtiu mutantných embryí medzi E10,5 a 11,5 p.c. (po kopulácii) vedie. V tkanivovej kultúre chránia BMP tiež kardiomyocyty pred apoptózou. Pretože BMP-10 je vysoko exprimovaný v srdciach dospelých myší a ľudí, budú vedci analyzovať úlohu BMP-10 pri prežití a starnutí kardiomyocytov na transgénnych myších modeloch. Očakávajú, že hlbšie pochopenie úlohy BMP povedie k novým terapeutickým metódam pri srdcových ochoreniach (Obr).
Opravné procesy v starnúcom alebo poškodenom srdci sú charakteristické tvorbou nefunkčného jazvového tkaniva. Regenerácia starnúcich sŕdc - ako je vysvetlené vyššie - nie je možná kvôli obmedzeniu schopnosti dospelých buniek srdcového svalu deliť sa a nedostatku dostatočného množstva kmeňových buniek srdca. Vedci z MPI sa preto pokúšajú prelomiť mitotický blok kardiomyocytov manipuláciou s bunkovým aparátom. Skúmajú najmä úlohu transkripčných faktorov E2F a katalytickej podjednotky enzýmu telomerázy pri iniciácii bunkového cyklu a potenciálne použitie dominantných negatívnych verzií p53 a p73 na prevenciu apoptózy buniek srdcového svalu.
Vedci: Izabella Pietrowska, Thomas Kubin, Zhipei Liu
V hornej časti obrázka je myšacie srdce zobrazené po ligácii LAD, koronárnej cievy. Podviazanie tepny vedie k zreteľne viditeľnému masívnemu infarktu. V dolnej časti obrázka bol do srdca injikovaný adenovírus, ktorý exprimuje reportérový gén, ktorý sa dá zviditeľniť jednoduchou modrou farbou. Génový prenos do srdcového tkaniva predstavuje budúcu možnosť liečby srdcového zlyhania.
Srdcová regenerácia zeleného mloka (Notophtalmus viridescens)
Niektoré organizmy majú schopnosť indukovať postmitotické bunky u iných druhov, aby sa znovu dostali do bunkového cyklu a dokonca regenerovali celé orgány alebo časti orgánov. Známym členom tejto rodiny zvierat je mlok Notophtalmus viridescens, ktorý je známy svojou schopnosťou regenerovať amputované končatiny alebo chvosty a niektoré ďalšie štruktúry. N. viridescens je jedným z mála stavovcov, ktorý je tiež schopný regenerovať tkanivo srdcového svalu (Obr). Tím vedcov z MPI v Bad Nauheime porovnáva profily expresie nepoškodeného a regenerujúceho sa srdcového tkaniva s cieľom identifikovať molekuly, ktoré riadia regeneračnú kapacitu srdca mloka. Údaje z tohto skríningu sa porovnávajú s výsledkami podobných skríningov na myšom modeli infarktu myokardu. Vedci doteraz vytvorili čipy DNA so 100 000 cDNA a použili ich na identifikáciu génov, ktoré vykazujú rozdielnu expresiu v regenerujúcom a odpočívajúcom srdci. Podrobná funkčná analýza molekulárnej dráhy, ktorá určuje regeneráciu srdca u mlokov, je ďalším krokom, ktorý sa v súčasnosti implementuje pomocou rôznych prístupov.
Vedci: Thilo Borchadt, Julia Kruse, Thomas Kubin, Thomas Böttger, Rene Zimmermann
Zobrazený je „červeno bodkovaný zelenkastý vodný mlok“ (Notophtalmus viridescens), v ktorom bola poškodená časť srdca (oblasť vyznačená bielou farbou). Intaktné bunky srdcového svalu, ktoré v poškodenej oblasti prakticky chýbajú, majú zelenú farbu. Na rozdiel od ľudí, mlok dokáže poškodené miesto prestavať a v dospelosti tiež úplne normálne srdce.
Identifikácia génov, ktoré riadia diferenciáciu kardiomyocytov
V minulosti boli identifikované rôzne gény, ktoré prispievajú k diferenciácii kardiomyocytov a k morfogenéze srdca. Napriek tomu je veľmi pravdepodobné, že v špecifickom tvare srdca hrá úlohu podstatne väčší počet génov. Komplexné funkčné prístupy k identifikácii takýchto génov pre cicavce zatiaľ neexistujú. Výskumná skupina na MPI využíva stratégiu širokouhlej obrazovky genómu založenú na diferenciácii embryonálnych kmeňových buniek. Používa komplexné retrovírusové knižnice siRNA na identifikáciu génov, ktoré zohrávajú rozhodujúcu úlohu pri diferenciácii kardiomyocytov. Identifikované gény sa používajú na diferenciáciu embryonálnych kmeňových buniek (bunky ES) in vitro prostredníctvom tvorby embryoidných telies (EBs; Obr. 3B) a in vivo použitím tetraploidných agregovaných chimér.
Vedecký pracovník: Andre Schneider, Thomas Böttger, Dietmar von der Ahe
Diferenciácia embryonálnych kmeňových buniek (ES) na kardiomyocyty po liečbe embryonálnych tiel (EB) rastovým faktorom FGF-2 počas troch dní. A: nediferencované bunky; B: Embryonálne telieska po 3 dňoch liečby FGF-2; C: Kardiomyocyty pozitívne na Sarcomere MyHC (MF-20) sa diferencovali od embryonálnych tiel po liečbe 3 ng/ml FGF-2.
Starnutie srdca a oxidačný stres: Gény SIR a kontrola energetického metabolizmu
Reaktívne formy kyslíka (ROS = kyslíkové radikály) spôsobujú v bunke množstvo degeneratívnych zmien a vedú k predčasnému starnutiu bunky. Všeobecne sa akumulácia ROS považuje za hlavnú príčinu zvýšeného starnutia buniek. Tkanivá, ktoré pozostávajú hlavne z postmitotických buniek, sa javia ako obzvlášť citlivé na poškodenie ROS, pretože majú iba obmedzený potenciál regenerácie. Presné vzťahy medzi oxidačným stresom a starnutím zatiaľ nie sú úplne známe Obr. Je však zrejmé, že zvýšený oxidačný stres vedie k nestabilite energetického metabolizmu. Nevyvážený energetický metabolizmus pravdepodobne vedie k zníženej aktivite rodiny génov SIR (tichý informačný regulátor). Gény SIR pravdepodobne inaktivujú špeciálne chromatínové domény (prostredníctvom deacetylácie histónov závislých od NAD) a tým vykonávajú ochrannú funkciu. Podľa tejto myšlienky nadmerná expresia SIR2 v kvasinkách (Saccharomyces cervisiae) k výraznému zvýšeniu životnosti.
Vedci z MPI pre výskum srdca a pľúc vytvorili rôzne myšie línie, ktoré im umožňujú skúmať úlohu oxidačného stresu, starnutia a deaktivácie chromatínu. Za týmto účelom skonštruovali podmienene aktívnu alelu SOD2 (superoxiddismutáza), ktorá umožňuje inaktiváciu a aktiváciu génu v určitých obdobiach v srdcovom svale. V druhej sérii experimentov je cDNA SIR2 umelo nadmerne exprimovaná v srdci. Ďalej skúmajú vplyv normálnej kalorickej a hypokalorickej potravy na oxidačný stres a starnutie buniek pomocou zodpovedajúcich profilov expresie kardiomyocytov. Analyzujú tiež súvislosť medzi oxidačným stresom a inaktiváciou génovej chromatíny krížením myší s deficitom SOD2 s myšami, v ktorých je nadmerne exprimovaný SIR2.
Vedci: Eva Bober, Susanne Weinlich, Olesya Vakrusheva
Enzým "manganizovaná superoxiddismutáza (MnSOD)" zvyšuje mieru prežitia fibroblastov za hyperoxických podmienok. Kontrolné fibroblasty a tie, ktoré nadmerne exprimujú MnSOD, sa kultivovali za normálnych (20% O2 = „normoxia“) a hyperoxických (85% O2 = hyperoxia) podmienok. Obrazy fázového kontrastu dokumentujú významne vyššiu mieru prežitia pri oxidačnom strese v bunkách nadmerne exprimujúcich MnSOD. Nadexpresia MnSOD sa dá rozpoznať podľa zelenej fluorescencie (ľavá strana a stred). Pravá strana obrázku: Modré sfarbenie dokumentuje indukovanú starnutie (starnutie) buniek po podaní 200 nm doxorubicínu. V bunkách s nadmernou expresiou MnSOD je starnutiu do značnej miery zabránené.
Riadenie migrácie svalových prekurzorových buniek indukčnými a autonómnymi signálmi z bunky
Migrácia je dôležitou vlastnosťou myogénnych buniek (buniek svalových prekurzorov) počas organogenézy a regenerácie orgánov. V minulosti sa vedcom podarilo preukázať, že gén Homeobox Lbx1 reguluje bunkovú autonómnu migráciu svalových prekurzorových buniek v končatinách. Ich výsledky dokázali, že Lbx1 je kľúčovým regulátorom migrácie svalových prekurzorových buniek a je potrebný na cielenú migráciu prekurzorových buniek svalov zadnej končatiny a extensorových svalov prednej končatiny (Obr). Pomocou odčítania cDNA heterozygotných a homozygotných mutantných buniek Lbx1 boli vedci schopní identifikovať rôzne predpokladané cieľové gény Lbx1. V súčasnosti prebieha funkčné vyšetrovanie týchto génov. Ďalej pracovná skupina skúma signálne transdukčné kaskády, ktoré sú nevyhnutné pre pohyblivosť buniek a migráciu svalových prekurzorových buniek u dospelých myší a kuracích embryí.
Vedci: Stefan Günther, Svetlana Oustanina
Deaktivácia génu Homeobox Lbx1 vedie k zastaveniu migrácie buniek svalového prekurzora do končatín. Cielenou mutagenézou sa do génu Lbx1 zaviedol bakteriálny reportérový gén. Tento genetický trik na jednej strane vypína aktivitu génu Lbx1 a na druhej strane zviditeľňuje bunky, v ktorých by Lbx1 normálne bol. Prvý a tretí riadok zobrazujú homozygotné mutanty, druhý a štvrtý riadok heterzygárne mutanty. Na obrázkoch ca i je jasne viditeľné, že bunky prekurzorov svalov označené modrou farbou nemôžu migrovať do zadného konca, ale „uviaznuť“ v kufri.
Regulácia telesnej hmotnosti a funkcie srdca prostredníctvom neurálnych génov bHLH
V rámci skríningu neuronálne exprimovaných génov bHLH (transkripčné faktory, ktoré obsahujú základnú doménu helix-slučka-helix) boli vedci z MPI v Bad Nauheime schopní pred niekoľkými rokmi identifikovať množstvo rôznych cDNA a génov. Analyzujú najmä dva gény NSCL1 a NSCL2. Aj keď inaktivácia NSCL1 neviedla k nijakej zjavnej neuronálnej dysfunkcii, myši s mutáciou NSCL1 zomierajú predčasne, pravdepodobne v dôsledku srdcových dysfunkcií, ktoré môžu byť vyvolané vegetatívnou dysfunkciou. Myši s deficitom NSCL2 trpia tiež mnohými neuroendokrinnými poruchami (Obr). Kombinovaná inaktivácia oboch génov vedie k zníženiu množenia nervových buniek a zhoršeniu diferenciácie v čuchovom epiteli.
Vedcov zaujímajú molekulárne a fyziologické procesy, ktoré sú základom týchto fenotypov. Osobitná pozornosť sa venuje analýze cieľových génov NSCL1 a NSCL2 a spojeniu medzi bunkovou proliferáciou a diferenciáciou. Ďalším zameraním budúcich aktivít v tomto projekte je skúmanie funkcie NSCL2 v dospelom organizme a mechanizmu abnormalít srdcového rytmu a vegetatívnych dysfunkcií u mutantov NSCL1.
Vedecká pracovníčka: Karen Ruschke, Thomas Schmidt
Obezita v dôsledku dysfunkcie nervového systému: Cielená inaktivácia základného transkripčného faktora NSCL-2 helix-slučka-helix, ktorá je exprimovaná v neurónoch, vedie u myší k výraznej obezite. Vzhľad myši svojim molekulárnym podpisom pripomína ľudský Prader-Williho syndróm.
(2) Zlepšenie a zrýchlenie regenerácie tkaniva: oprava a výmena poškodených buniek srdca a kostrového svalstva
Regeneratívna medicína je nová a zaujímavá oblasť v biologickom a lekárskom výskume. Je založený priamo na výsledkoch základného výskumu týkajúceho sa bunkovej diferenciácie a vývoja. Novšie objavy predpokladajú, že predchádzajúce rozhodnutia prijaté bunkami nie sú nezvratné, ale je možné ich zvrátiť a zmeniť. Takýto „dynamický koncept hľadania identity“ bunky je založený na myšlienke, že udržiavanie bunkového fenotypu si vyžaduje nepretržitú reguláciu. To v zásade znamená, že by malo byť možné preprogramovať diferencované bunky, a tým posilniť regeneračné vlastnosti tkanív a orgánov.
Selekcia a manipulácia s mezenchymálnymi kmeňovými bunkami na generovanie myoblastov a kardiomyocytov
Mesenchymálne kmeňové bunky (MSC) sa vyskytujú v stróme (podpornom tkanive) rôznych orgánov. Kostná dreň obsahuje MSC, ktoré sú schopné prevziať vlastnosti rôznych typov buniek, vrátane srdcových a kostrových svalov a neuroektodermálnych buniek (Obr). Použitie geneticky značených MSC odvodených z kostnej drene umožnilo výskumníkom získať prehľad o diferenciačnom potenciáli MSC in vivo sa má odobrať po injekcii do skorých embryí myší. Kombináciou špecifických stratégií genetického výberu a indukčných protokolov bolo možné vytvoriť relatívne jednotné bunkové populácie, ktoré majú vlastnosti svalových buniek a ktoré je možné v prípade potreby použiť na terapeutické účely.
Skupina tiež pracuje na optimalizácii metód efektívnej selekcie a expanzie MSC na generovanie myoblastov a kardiomyocytov. Určujú tiež terapeutický potenciál týchto buniek. Takýto prístup však môže byť úspešný, iba ak je možné dozvedieť sa viac o signáloch a procesoch potrebných na určenie a diferenciáciu na rôzne bunkové línie.
Vedecký pracovník: Fikru Belema Bedada, Kerstin Broich
Zdá sa, že mezenchymálne kmeňové bunky si svoju identitu osvojujú prednostne fúziou s existujúcimi bunkami kostrového a srdcového svalu. Tento záver vyplýva z uvedeného experimentu, v ktorom boli mezenchymálne kmeňové bunky označené červeným farbivom a kultivované zeleno sfarbenými svalovými bunkami cez membránu s pórmi rôznych veľkostí. Mesenchymálne kmeňové bunky mohli exprimovať svalové bielkoviny (oranžové) iba vtedy, ak veľkosť pórov filtra bola dostatočná na to, aby umožnili bunkám voľný priechod. Ak to nebolo zaručené, v mezenchymálnych kmeňových bunkách sa nenašli žiadne svalové proteíny.
Satelitné bunky: kontrola proliferácie, výstupu z bunkového cyklu a diferenciácie počas regenerácie tkaniva
Satelitné bunky sú kmeňové bunky kostrových svalov. Nachádzajú sa medzi bazálnou vrstvou a plazmatickou membránou (sarkolémou) myotubov, kde sa aktivujú pri cvičení, pri úrazoch svalov alebo pri ochoreniach, ktoré poškodzujú svalové vlákna. Vedci analyzujú mechanizmy, ktoré riadia proliferáciu, výstup bunkového cyklu a diferenciáciu satelitných buniek počas regenerácie svalového tkaniva (8. Obr). Transplantáciou geneticky označených buniek z myších mutantov s cielenými mutáciami v rodine génov pre FGF rastový faktor preukázali, že myogénne kmeňové bunky sú autokrinne závislé od FGF. Použitie dominantných negatívnych retrovírusov naznačuje, že FGF iniciujú kaskádu závislú od ras a ral, ktorá iniciuje bunkovú migráciu.
Vedci určujú potenciál generických a geneticky modifikovaných rastových faktorov pri liečbe a prevencii chorôb kostrového svalstva u transgénnych zvierat ako predklinický model. Používajú sa dva rôzne prístupy: 1) generovanie transgénnych zvieracích modelov na analýzu funkcie rastových faktorov, predovšetkým FGF, myostatínu a SF/HGF; 2) Výber geneticky modifikovaných rastových faktorov založených na myostatíne s modifikovaným biologickým spektrom. Analýza rastových faktorov počas regenerácie je podporená experimentmi, ktoré skúmajú funkciu bunkových autonómnych procesov pri aktivácii a údržbe satelitných buniek.
Vedci: Svetlana Oustanina, Michal Mielcarek, Stefan Günther, André Schneider
Spárovaný boxový gén Pax7 je zodpovedný za udržiavanie zásoby svalových kmeňových buniek. Modrá farba označuje aktivitu génu Pax7 v satelitných bunkách, ktoré sú umiestnené na izolovaných svalových vláknach v „satelitnej polohe“. U myšacích mutantov Pax7 je počet satelitných buniek počas dospievania (P 11) myši iba mierne znížený, ale s pribúdajúcim vekom (P 60) rapídne klesá. Mutantné satelitné bunky Pax7 navyše vykazujú stratu expresie markéra kmeňových buniek CD34.