DIPLOMOVÁ PRÁCA. Biologická aktivita novo syntetizovaného derivátu kyseliny tiokarbónovej (MAH4 HCl) na izolovaných orgánoch morčiat
1 DIPLOMOVÁ PRÁCA Biologická aktivita novo syntetizovaného derivátu kyseliny tiokarbónovej (MAH4 HCl) na orgánoch izolovaných z morčiat Autor Özlem Çetinkaya Požadovaný akademický titul Magistra der Pharmazie (Mag.pharm.) Viedeň, 2012 Číslo štúdie podľa študijného listu: A 449 Vedúci podľa študijného listu: Ao. Univ.-Prof. DR. Christian Studenik
2 Za moju rodinu a Bernharda
3 Poďakovanie Najskôr by som sa chcel poďakovať svojim rodičom Firdesovi a Mehmetovi Çetinkayovi, mojim súrodencom Eylem, Eylen, Özdenovi a Muratovi, ako aj môjmu snúbencovi Bernhardovi, ktorý za mnou stál počas celého štúdia. S mojím nadriadeným Ao. Univ.-Prof. DR. Z celého srdca ďakujem Christianovi Studeniku za cenné impulzy a za veľkú, ľudskú a kompetentnú podporu. Chcel by som sa poďakovať aj pánovi Ao. Univ.-Prof. DR. Thomas Erker a pracovná skupina Oddelenia lekárskej/farmaceutickej chémie za poskytnutie testovanej látky. Rád by som tiež srdečne poďakoval svojim priateľom Alme Seydinovic, Milade Avdic a Hamdi Cananovi za aktívnu podporu. S nimi bolo učenie v knižnici AKH oveľa zábavnejšie. Vždy si bol so mnou v dobrých i zlých časoch a v mojom srdci budeš mať vždy skvelé miesto. Potom by som sa chcel poďakovať mojim svokrovcom, Mastalovi, za veľkú podporu pri korektúre práce.
4 Obsah 1 Úvod Srdce Hypertenzia Sírovodík Ciele Materiál a metodika Testovaná látka MAH4 HCl Rozpúšťadlo Pokusné zvieratá Fyziologický roztok elektrolytu Použité orgány Prípravné materiály Použité Pravé predsieň Pľúcna tepna Papilárny sval (Musculus papillaris) Tenké črevo (Ileum Terminalis) Aorta (Aorta descendens) Prístroj na napájanie Karbogén Vykonanie experimentov Účinok látok na izolované orgány morčaťa Atrium dexter (pravá predsieň) Musculus papillaris (papilárny sval) Terminálne ileum (tenké črevo) Aorta zostupujúca pľúcna tepna (pľúcna tepna)
5 3.6.2 Vyšetrenia mechanizmu účinku MAH 4HCL v čreve Vyšetrenia glibenklamidom a nitro-L-arginínom Vyhodnotenie údajov a štatistík Atrium dexter Musculus papillaris Aorta, Arteria pulmonalis, Terminalis ileum Výsledky štatistík Výsledky testovanej látky MAH 4HCl Atrium cordis dexter Musculus descendens pulmonary artery terminal ileum Skúmanie mechanizmu účinku testovanej látky MAH4 HCl na črevo Účinok MAH4 HCl v kombinácii s NO-L-arginínom na črevo Účinok MAH4 HCl v kombinácii s glibenklamidom na črevo Diskusia Zhrnutie Bibliografia Životopis
15 3 Materiál a metodika 3.1 Testovaná látka Látka, ktorá sa má testovať, bola testovaná na Fakulte prírodných vied na Katedre liečivej a farmaceutickej chémie organizáciou Ao. Univ. Prof. Dr. Thomas Erker novo syntetizovaný a sprístupnený na testovanie MAH4 HCl Obrázok 1: Chemická štruktúra MAH4 HCl MG: 297,89 g/mol oktyl [2- (dimetylamino) etoxy] metántioát hydrochlorid 10
16 3.1.2 Rozpúšťadlo Na uskutočnenie experimentov bolo potrebné látku predtým úplne rozpustiť vo vhodnom rozpúšťadle. MAH4 HCl bol veľmi rýchlo a úplne v dist. Aqua rozpustný. Počiatočná hmotnosť bola vždy zvolená tak, aby sa v kúpeľoch pre orgány po úplnom kumulatívnom pridaní dosiahla koncentrácia 100 umol/l v nádobe. K dispozícii boli orgánové kúpele 8 ml a 25 ml. Výpočet: MG/4/100 = výpočet pre veľkú nádobu MG/12,5/100 = výpočet pre malú nádobu Tabuľka 2 zobrazuje vypočítané a použité zásobné roztoky: Tabuľka 2: Zásobné roztoky Látka Molárna hmotnosť MAH4 HCl 297,89 g/mólový objem orgánového kúpeľa v počiatočnej hmotnosti testovanej látky (100 μmol/l)/ml orgánový kúpeľ 80, 74 Zásobné roztoky sa pridávali každých štyridsať päť minút pomocou Finnovej mikropipety a meral sa účinok. Pridané koncentrácie sú uvedené v tabuľke 3 nižšie. Tabuľka 3: Reprezentácia pipetovacej schémy Pridané množstvo Konečná koncentrácia 3 μl 3 μmol/l 7 μl 10 μmol/l 20 μl 30 μmol/l 70 μl 100 μmol/l 11
21 Obrázok 4: Schematické znázornenie srdca (Netter FH 2003) 16
23 vyhralo 3 cm dlhý kus. Izoláciu bolo treba robiť veľmi opatrne, pretože by mohla poraniť a preťažiť aortu. Aorta, rovnako ako všetky ostatné prípravky, sa potom umiestnila do Petriho misky s Tyrodom a pripevnila sa k korkovej podložke dvoma disekujúcimi ihlami. Museli ste sa uistiť, že nie je preťažený. Okolité tkanivo, tuk a krv sa opatrne odstránili a nakrájali na kúsky dlhé približne 2 mm. Vadné a nepravidelné časti boli zlikvidované. Obrázok 6: Schematické znázornenie aorty (Netter FH 2003) 18
24 3.5 Použité prístroje Pri pokusoch boli použité dva rôzne prístroje. V aparáte 1 sa uskutočňovali experimenty pre papilárne svaly a v aparáte 2 aortálne, predsieňové a intestinálne experimenty. Orgány boli zavesené na silových prevodníkoch cez strieborný drôt. Prevodník sily konvertoval mechanickú silu na elektrický signál a odovzdal ho zosilňovaču, ktorý zosilnil elektrický signál a pomocou pera ho nakreslil na milimetrový papier. Aby bolo možné experimenty porovnať, bolo treba vždy pracovať za rovnakých podmienok, pokiaľ ide o prísun kyslíka, teplotu, hodnotu pH, produkciu a zloženie tyródy. Prístroj 1 Prístroj 1 sa používal iba na experimenty na papilárnych svaloch. Konštrukcia: Prístroj obsahuje vodný kúpeľ z akrylového skla. Do tohto vodného kúpeľa vyčnieva svalová komora. K dispozícii je tiež statív, ku ktorému je pripevnený snímač sily, jemný pohon a držiak orgánu. Pre lepšie pochopenie pozri obrázok 6. 19.
25 Obrázok 7: Náčrt prístroja 1 Svalná komora obsahuje 25 ml, takže pre Tyrode bol použitý rovnaký objem. Vodný kúpeľ bol termostaticky regulovaný na konštantných 35 ° C. Tak vznikli fyziologické podmienky. Výživový roztok sa musel upraviť na túto hodnotu, a preto bol Tyrode umiestnený do komory 10 minút pred experimentom. Príprava bola predtým opísaná v kapitole. Prípravok svalu sa umiestnil do kontaktu so silovým prevodníkom strieborným háčikom cez strieborný drôt, papilárny sval sa upol medzi elektródu a disk z plexiskla. Potom sa držiak spustil do svalovej komory tak, aby vzorka stála úplne v Tyrode. Papilárne svaly nebijú spontánne ako predsiene, ale musia sa stimulovať. To sa dosiahlo stimulátorom Accupulser (model Isostim 301T. WPI, Hamden, CT, USA). Kontrakcia sa prenášala na silový prevodník drôtom chloridu strieborného, zosilňovala sa v zosilňovači a prenášala sa na ploché pero. 20
26 Obrázok 8: Originálny obrázok prístroja Prístroj 2 Prístroj 2 (pozri obrázok 8) sa použil na testy na aorte, pľúcnej artérii, terminálnom ileu a pravej predsieni. Vodný kúpeľ sa ochladil na 37 ° C. V prípade aorty a pľúcnej artérie boli vzorky v tvare prstenca pripevnené priamo k silomeru pomocou strieborného drôtu. V črevách a predsieni boli predtým na dva konce pripevnené dva strieborné háčiky, ktoré boli tiež spojené s prevodníkom sily. V prístroji 2 boli testované predmety spustené do orgánových kúpeľov naplnených Tyrodom. Organické kúpele boli tiež nastavené na 37 ° C a boli plynované. Jemným pohonom bolo aplikované predpätie, potom bolo vynútené stiahnutie a tieto kontrakcie alebo zmeny v nich boli prevedené na aktuálne signály a zaznamenané. 21. deň
27 Obrázok 9: Náčrt prístroja 2 22
28 Obrázok 10: Originálne zobrazenie prístroja Prevodník síl Pomocou prevodníka sily sa mechanické zmeny prevádzajú na elektrické pomocou takzvaného Wheatstoneovho mostíka, ktorý umožňuje meranie. V meniči sily sú strie. Keď došlo k zmenám v sile kontrakcie orgánov, úmerne sa zmenila aj odolnosť proti predĺženiu a prúdenie. Zmeny v kontrakcii a relaxácii svalov sa dajú preniesť na plošný záznamník (Flatbed Recorder, model BD 112, Company.) Cez zosilňovač (Transbridge TM, 4-kanálový zosilňovač prevodníka, World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA). Kipp & Zonen). To prenáša impulzy na milimetrový papier. 23
29 Obrázok 11: Náčrt prevodníka sily Zásoba karbogénu Pri všetkých experimentoch bolo potrebné neustále zásobovanie orgánov plynom karbogénu, aby sa dosiahol dostatočný prísun kyslíka, rovnomernej zmesi účinnej látky a aby sa udržala konštantná hodnota ph. To bolo možné pomocou hadicového systému, ktorý bol pripojený ku každému orgánu. Sklenené frity boli priamo pred vchodom do kúpeľov. Umožnili jemné rozprašovanie a spolu so svorkami na začiatku hadíc optimálne dávkovanie vzduchu. Obrázok 12: Originálny obrázok dodávky plynu 24
Zobral sa 33 KCI a rozpustil sa v 100 ml Tyrode. Tu tiež dochádza k rýchlej kontrakcii, ktorá rovnako rýchlo opäť poklesla. Jeden čakal asi 45 minút, kým sa vytvorila stabilná fáza plató. Látka bola pridaná opäť podľa známej schémy pľúcnej tepny (pľúcna tepna). Priebeh experimentu bol rovnaký ako pre aortu, jediný rozdiel bol v napätí, ktoré bolo vždy konštantné pri 5 mV, t. J. 9,81 mil., Bolo skúmanie mechanizmu účinku MAH 4HCL na čreve Vyšetrenia s glibenklamidom a nitro-L-arginínom Črevo sa pripravilo podľa popisu v kapitole a pripevnilo sa na prístroj 2. O priebehu experimentu pozri kapitolu Tu sa počkalo do konštantnej fázy plató, potom sa pridali antagonisti gliebenclamid alebo nitro-L-arginín, pričom konečná koncentrácia v orgánovom kúpeli bola 100 umol/l. Po 45 minútach sa pridalo 15 ul zásobného roztoku a zmes sa nechala pôsobiť ďalších 45 minút, potom sa experiment ukončil. Glibenklamid Obrázok 13: Glibenklamid (MW = 494,0 g/mol) 28
36 nulový riadok. Takto by ste mohli proporčne porovnať hodnoty. Z tohto dôvodu sa musel brať do úvahy kalibračný faktor, ktorý zodpovedal 5 mv na 1 cm alebo 0,98 mn. Ak ste pracovali pri 2 mv, hodnota sa musela vynásobiť 0,2 a pri 10 mv 2 Štatistika Pre štatistické vyhodnotenie kontrakčnej sily a frekvencie zdvihov boli vypočítané stredné hodnoty a štandardná chyba stredných hodnôt (SEM). Na výpočet týchto štatistických hodnôt a EC50 sa použil program Sigma Plot 9.0. Tento program vysvetľuje priemernú účinnú koncentráciu účinnej látky v mmol/l, pri ktorej sa dosiahne polovica kontrolnej hodnoty. Aby sa zistila pravdepodobnosť chyby, bol vykonaný Studentov t-test pre párové pozorovania. Hodnoty menej ako 0,1% (P 0,001) boli vysoko významné a hodnoty 5% (P 0,05), 1% (P 0,01) boli významné. Hodnoty s pravdepodobnosťou chyby> 5% (P> 0,05) neboli významné hodnoty. 31
38 Tabuľka 5: Výsledky testu MAH 4HCl na pravej predsieni MAH4HCL f ± SEM f ± SEM (µmol/l) (x/min) (%) Počet pokusov o pravdepodobnosť chyby (P) n Kontrola 180 ± 8,66 0 ±, 50 ± 8,54 1,52 ± 2,60 4 ns, 50 ± 12,50-1,18 ± 5,08 4 ns ± 9,24-15,27 ± 3,87 4 0, ± ± 0 4 0,001 V Tabuľka 5 uvádza aritmetické priemerné hodnoty (f) v tepoch/minútu a v percentách, ako aj ich štandardné chyby (SEM) pre príslušnú koncentráciu. n je počet pokusov. 33
39 Diagram 1: Krivka účinku na koncentráciu MAH4 HCl v pravej predsieni AURRO n = 4 MAH 4 HCL EC 50 = 49 µmol/l 25 Pokles frekvencie úderov (%) Konc. (Μmol/l) Tento diagram zobrazuje zmenu frekvencie úderov ako funkciu množstvo látky v orgánovej komore. Frekvencia nárazu bola zadaná v% na osi y a koncentrácia testovanej látky na osi x. Hodnota EC50 bola uvedená prerušovanými čiarami a je 49 μmol/l. Bodky ukazujú vypočítané stredné hodnoty frekvencie rytmu pri zodpovedajúcich koncentráciách a stĺpce ich štandardné chyby. 34
40 Obrázok 15: Originálny záznam chronotropného účinku MAH4 HCl 12 s 1 cm = 0,98 mn Negatívny chronotropný účinok je možné vyčítať z počtu úderov. 35
41 4.1.2 Musculus papillaris Uskutočnili sa štyri testy na hodnotenie inotropného účinku na papilárny sval. Kontrolná hodnota bola 1,58 ± 0,45 min. Pridanie látky malo za následok zníženie sily kontrakcie. Pri koncentrácii 3 µmol/l bol tento pokles -15,05 ± 8,34% a bol stále väčší a väčší. Pri konečnej koncentrácii 100 umol/l bola kontrakčná sila 0,08 ± 0,02 mN alebo 94,92 ± 1,58% kontrolnej hodnoty. Tabuľka 6: Účinok MAH 4HCl na papilárny sval MAH4HCL fc ± SEM fc ± SEM (µmol/l) (mn) (%) Počet pravdepodobnosti pokusov o chybu (P) n kontrola 1,58 ± 0,45 0 ±, 23 ± 0, 43-15,05 ± 8,34 4 0,99 ± 0,36-40,46 ± 5,70 4 0,57 ± 0,19-65,92 ± 3,05 4 0,08 ± 0,02 - 94,92 ± 1,58 4 0,001 Táto tabuľka zobrazuje hodnoty aritmetického priemeru (fc) a ich štandardnú odchýlku (SEM) pri prítomnej koncentrácii v mn aj v percentách. 36
42 Diagram 2: Krivka závislosti účinku na koncentrácii MAH4 HCl na papilárnom svale 0 PAPILLÁRNY SVAL MAH 4 HCl n = 4 EC 50 = 15 µmol/l pokles kontrakčnej sily (%) konc. (Μmol/l) Tento diagram ukazuje zmenu kontrakčnej sily ako funkciu množstvo látky v orgánovej komore. Pokles kontrakčnej sily v% bol zadaný na osi y a koncentrácia testovanej látky v μmol/l na osi x. Hodnota EC50 bola uvedená prerušovanými čiarami a je 15 μmol/l. Bodky ukazujú vypočítané stredné hodnoty kontrakčnej sily pri zodpovedajúcich koncentráciách a stĺpce ukazujú ich štandardné chyby. 37
43 Obrázok 16: Originálny záznam inotropného účinku MAH4 HCl 1 cm = 0,98 mn Zníženie kontrakčnej sily je zreteľne vidieť na dĺžke amplitúdy. Dĺžka amplitúdy klesá so zvyšujúcou sa koncentráciou testovanej látky v orgánovej komore, čo je založené na negatívnom inotropnom účinku testovanej látky. 38