DuchenneBeckerova svalová dystrofia (delécie delécie MLPA) - Synevo
Všeobecné informácie
Dystrofinopatie zahŕňajú spektrum svalových ochorení spôsobených mutáciami v géne DMD, ktorý kóduje dystrofín. Klinické formy ochorenia majú rôznu závažnosť a ukazujú prenos súvisiaci s chromozómom X; medzi najmiernejšie fenotypy patrí asymptomatické zvýšenie aktivity kreatínkinázy v sére, svalové kŕče sprevádzané myoglobinúriou a izolovaná štvorhlavá myopatia; na opačnom póle sú progresívne svalové poruchy klasifikované do dvoch širokých kategórií: Duchenne/Beckerova svalová dystrofia, keď sú postihnuté hlavne kostrové svaly a dilatovaná kardiomyopatia spojená s mutáciami DMD, keď je poškodenie srdca v popredí 1 .
V roku 1986 identifikoval Kunkel gén Duchenneovej svalovej dystrofie ako lokalizovaný v páse Xp21, a tak potvrdil spôsob prenosu choroby spojeného s X.
Beckerova svalová dystrofia má prevalenciu 24 prípadov na milión a má tiež prenos súvisiaci s chromozómom X. Fenotyp sa generuje genetickými mutáciami odlišnými od tých, ktoré sa podieľajú na Duchennovej chorobe, ale postihnutý gén je bežný (DMD). Beckerova dystrofia začína klinicky vo vyššom veku a má pomalší klinický priebeh. Imobilizácia na invalidnom vozíku nastáva po 20. roku života; Aj keď poškodenie kostrového svalstva je menej závažné ako pri Duchennovej chorobe, srdcové zlyhanie spôsobené dilatovanou kardiomyopatiou je hlavnou príčinou chorobnosti a úmrtnosti.
V dôsledku prenosu spojeného s X sa Duchennova choroba aj Beckerova choroba vyskytujú takmer výlučne u chlapcov. Veľmi zriedka sa u žien s mutáciami DMD rozvinie fenotyp Duchenne/Becker v dôsledku náhodnej inaktivácie neovplyvneného chromozómu X, asociácie Turnerovho syndrómu (X0) alebo uniparentálnej dysómie. Takže vo väčšine prípadov sú ženy asymptomatické a dve tretiny z nich vykazujú zvýšenie aktivity kreatínkinázy 4 .
Dilatovaná kardiomyopatia spojená s mutáciami génu DMD je charakterizovaná dilatáciou ľavej komory a kongestívnym zlyhaním srdca. U mužov choroba začína klinicky vo veku 20 až 40 rokov a má rýchly letálny vývoj, zatiaľ čo u žien dochádza k neskoršiemu nástupu a pomalšej progresii. Znaky a príznaky poškodenia kostrového svalstva zvyčajne chýbajú.
DMD je jediný gén spojený s dystrofinopatiami. Testy molekulárnej biológie, ktoré detekujú mutácie DMD, môžu diagnostikovať vo väčšine prípadov Dystrofiu Duchenne alebo Becker bez potreby biopsie svalov. Teoreticky majú všetci mužskí pacienti s Duchennovou dystrofiou a najmenej 85% pacientov s Beckerovou dystrofiou identifikovateľné mutácie DMD. Počet pacientov s dilatovanou kardiomyopatiou a identifikovateľnými mutáciami DMD nie je známy. Vo zvyšných prípadoch potvrdenie diagnózy potvrdzujú klinické údaje s rodinnou anamnézou, hladinou kreatínkinázy v sére, biopsiou svalov a analýzou dystrofínu 1 .
DMD je najväčší gén identifikovaný v ľudskom genóme; skladá sa zo 79 exónov a má vysokú mieru mutácií; vyjadruje sa hlavne v kostrových, hladkých a srdcových svaloch. Kódovaný proteín - dystrofín - sa podieľa na mechanickom spojení medzi extracelulárnou matricou a bunkovým cytoskeletom. Pri absencii dystrofínu je ovplyvnená celistvosť sarkolemmy a narušená stabilita svalového vlákna. Keď sa zvýši náchylnosť na mechanické poškodenie, svalové vlákna podstúpia opakované cykly nekrózy a regenerácie s prípadným vyčerpaním regeneračnej kapacity. DMD mutácie, ktoré spôsobujú buď úplnú absenciu dystrofínu, alebo produkciu skráteného proteínu, sú spojené s fenotypom Duchenne. Na druhej strane mutácie, ktoré ovplyvňujú strednú oblasť génu, vygenerujú kratší proteín, ktorý si však zachová svoje karboxy- a aminoterminálne domény, a tým aj svoju funkčnosť; sú spojené s Beckerovým fenotypom 2; 4 .
Veľké delécie zahŕňajúce jeden alebo viac exónov sú zodpovedné za približne 59% prípadov DMD a 65% prípadov Beckerovej dystrofie. Mutácie, ktoré indukujú predčasný výskyt stop kodónu, sa nachádzajú v 15% prípadov a duplikácie v 5% prípadov; vo zvyšných prípadoch existujú mutácie čítacieho rámca, inzercie/delécie, mutácie miesta zostrihu, ako aj mutácie missens.
Aj keď sa takmer všetky prípady DMD alebo Beckerovej dystrofie prenášajú X-viazaným spôsobom, v tretine prípadov neexistuje rodinná anamnéza, ide o mutácie de novo. Gonádový mozaizmus je zodpovedný za približne 20% nových prípadov Duchennovej svalovej dystrofie 4 .
Riziko rozvoja choroby u súrodencov postihnutej osoby závisí od stavu nositeľa matky. Z dôvodu X-viazaného prenosu dystrofinopatií sú ženy s 50% rizikom prenosu mutácie DMD v každom tehotenstve. Synovia dediaci mutáciu budú vždy ovplyvnení, zatiaľ čo dcéry dediace mutáciu budú prenášačmi a môže alebo nemusí sa u nich vyvinúť kardiomyopatia.
Muži s Duchennovou dystrofiou zvyčajne zomierajú pred reprodukčným vekom, zatiaľ čo muži s fenotypom Becker sa môžu množiť, takže všetky ich dcéry zdedia mutáciu spôsobujúcu ochorenie a ich synov to nebude mať vplyv.
Materské tety postihnutej osoby, ako aj ich deti, môžu byť vystavené zvýšenému riziku, že ochorejú alebo sa stanú nositeľkami v závislosti od ich pohlavia, rodinných vzťahov a stavu matkinej nositeľky.
Žena s postihnutým synom a iným príbuzným postihnutým matkou musí byť heterozygotná pre mutáciu DMD.
Žena s viac ako jedným postihnutým synom a negatívnou rodinnou anamnézou má buď zárodočnú mutáciu (mutácia DMD spôsobujúca ochorenie je prítomná vo všetkých jej bunkách), alebo gonadálny mozaicizmus (prítomný je mozaicizmus mutácie DMD spôsobujúcej ochorenie). iba v zárodočnej línii).
Ak je dieťa s ochorením Duchenne/Becker jediným postihnutým členom rodiny, musí sa vziať do úvahy niekoľko možností týkajúcich sa postavenia matky:
a) postihnutý syn má mutáciu de novo, ktorá bola výsledkom:
b) matka má de novo mutáciu; asi dve tretiny matiek chlapcov s dystrofiou Duchenne/Becker a bez rodinnej anamnézy nesú mutácie DMD; mechanizmy, pomocou ktorých sa u matky vyskytujú mutácie de novo, sú nasledujúce:
c) matka zdedila mutáciu od:
Genetické testovanie v kombinácii s analýzou väzby môže často určiť pôvod mutácie de novo. Táto analýza je dôležitá pre identifikáciu tej rodinnej vetvy, ktorá je vystavená zvýšenému riziku dystrofinopatie 1 .
Na detekciu mutácií génu DMD vo vzorkách periférnej krvi bolo vyvinutých niekoľko techník molekulárnej biológie, vrátane:
-
multiplexná PCR na detekciu delécií (miera detekcie
95%);
Technika MLPA pre gén DMD vyžaduje dva rôzne typy reakcií kvôli veľkému počtu exónov. Jedna reakcia zahrnuje zmes sond nazývaných PO34 pokrývajúca exóny 1-10, 21-30, 41-50 a 61-70. Druhá reakcia obsahuje zmes sond nazývaných PO35, ktorá pokrýva analýzu exónov 11-20, 31-40, 51-60 a 71-79. Štúdie ukazujú, že táto technika, ktorá „skenuje“ všetkých 79 exónov génu DMD súčasne na prítomnosť delécií/duplikácií, je užitočným diagnostickým nástrojom pre postihnutých mužov aj ženy prenášajúce 2; 5 .
Odporúčania pre genetické testovanie
- potvrdenie diagnózy Duchenne/Beckerova dystrofia u postihnutých osôb;
- testovanie vysokorizikových príbuzných na identifikáciu žien, ktoré sú nositeľkami; ideálne je vopred identifikovať mutáciu spôsobujúcu chorobu v rodine;
- prenatálna diagnostika vysoko rizikových tehotných žien pre mutáciu DMD; sa uskutočňuje analýzou DNA extrahovanej z buniek plodu získanou amniocentézou, ktorá sa zvyčajne uskutočňuje asi v 15-18 týždni tehotenstva alebo biopsia choriových klkov, asi v 10-12 týždni tehotenstva; mutácie spôsobujúce ochorenie musia byť identifikované pred prenatálnym testovaním 1, 3, 4 .
Odobratý exemplár - krv príde 3 .
Zberová nádoba - vacutainer obsahujúci EDTA ako antikoagulant 3 .
Zozbierané množstvo - 5 ml krvi 3 .
Dôvody zamietnutia skúsiť - použitie heparínu ako antikoagulancia; zrážané alebo hemolyzované vzorky 3 .
Vyskúšajte stabilitu - 7 dní pri 2 - 8 ° C 3 .
Spôsoby - analýza odstránení/duplikácií MLPA 3 .
Podávanie správ a interpretácia výsledkov
Delécie/duplikácie zistené v géne DMD a ich asociácia s fenotypom Duchenne/Becker budú komunikované podľa údajov z literatúry 3 .
Identifikácia mutácie spôsobujúcej ochorenie u mužov so sugestívnym klinickým obrazom a zvýšenými hladinami CK potvrdzuje diagnózu. Duchenne/Beckerove fenotypy najlepšie korelujú so stupňom expresie dystrofínu, ktorý je určený čítacím rámcom mediátorovej RNA získanej z mutantnej alely. Veľmi veľké delécie teda môžu viesť k absencii expresie dystrofínu; tiež niektoré delécie a duplikácie môžu zmeniť čítací rámec a spôsobiť produkciu silne skráteného proteínu, ktorý je spojený s fenotypom Duchenne. Beckerov fenotyp sa vyvíja, keď sa zachová určitá produkcia dystrofínu, ktorá čiastočne zachováva jeho funkciu; v týchto prípadoch ide o delécie alebo duplikácie, ktoré stavajú niektoré exóny na úroveň čítacieho rámca.
V rodinách, kde má postihnutý muž známe odstránenie alebo duplikáciu DMD, sa táto zmena hľadá aj u rizikových príbuzných. Absencia zmeny vylučuje stav dopravcu. Identifikácia mutácie DMD potvrdzuje stav nosiča; Pretože ženy majú zvýšené riziko vzniku kardiomyopatie, odporúča sa úplné srdcové vyšetrenie najmenej raz za 5 rokov po dosiahnutí veku 25 - 30 rokov 1 .
Limity a rušenie
Negatívny výsledok mutácie DMD v teste MLPA nevylučuje diagnózu u ľudí so sugestívnym klinickým obrazom. Vzhľadom na to, že bodové mutácie sú zapojené do 25-30% prípadov Duchenne-Beckerovej svalovej dystrofie, odporúča sa úplné sekvenovanie génu DMD.
V rodinách, kde nie je známa mutácia DMD, negatívny výsledok testu MLPA pre vysokorizikové ženy nevylučuje stav nosiča. Prítomnosť pozitívnej rodinnej anamnézy si vyžaduje sekvenovanie celého génu 1, 3, 4 .