Endodermálny potenciál diferenciácie v pečeni

1 Endodermálny, hepatálny diferenciačný potenciál dospelých a embryonálnych kmeňových buniek in vitro a in vivo predstavený absolventkou biotechnológie Annikou Wulf-Goldenberg z Berlína z Fakulty III procesných vied na Technickej univerzite v Berlíne, aby získal akademický titul doktor inžinierstva - Dr. Ing. - Schválená dizertačná práca Doktorandský výbor: Predseda: prof. Dipl.-Ing. DR. Reportér U. Stahl: Prof. Dr. Reportér R. Lauster: Dr. habil. Reportér I. Fichtner: Prof. Dr. Deň vedeckej diskusie J. Kurrecka: 30. marca 2010 Berlín 2010 D 83

pečeni

2 Vidíš, Momo, povedal zametač ulíc Beppo, je to takto: Niekedy máš pred sebou veľmi dlhú cestu. Myslíš si, že je to tak strašne dlhé; nikdy to nedokážeš, myslíš si. A potom sa začnete náhliť. A človek sa ponáhľa čoraz viac. Zakaždým, keď sa pozriete hore, uvidíte, že už nie je nič menej, čo vás čaká. A viac sa snažíš, bojíš sa a nakoniec si úplne zadýchaný a už nemôžeš. A cesta je stále pred vami. Takto sa to nedá. Nikdy by ste nemali myslieť na celú ulicu naraz, viete? Stačí myslieť na ďalší krok, potom na ďalší nádych, ďalší úder metlou. A len k ďalšiemu znova a znova. Potom je to potešenie; to je dôležité, potom robíte svoju prácu dobre. A tak to má byť. Zrazu si uvedomíte, že ste celú cestu spravili krok za krokom. Ani ste si nevšimli ako, a nedýchate. Toto je dôležité. Michael Ende, z Momo Za mojich rodičov, pretože ste ma naučili kráčať po mojej ulici s odvahou a dôverou.

5 častí 5 buniek. Nebola však dosiahnutá jasná diferenciácia na funkčný hepatocyt. Vybrané podmienky in vitro diferencovania podmieneného média a kokultúry umožnili bunkám CD34 + mierne sa diferencovať na pečeňové endodermálne bunky. Endodermálnu pečeňovú diferenciáciu je možné vyvolať v ľudských embryonálnych kmeňových bunkách línie SA002 systémami in vitro. Vybrané podmienky in vitro ukazujú, že priamy kontakt v kokultúre môže indukovať diferenciáciu efektívnejšie ako upravené médium v ​​kmeňových bunkách. Je však potrebné vylepšiť existujúce diferenciačné protokoly. Vyvinuté modely in vivo tvoria základ pre testovanie a porovnanie in vitro diferencovaných buniek.

11 Úvod 11 1 Úvod 1.1 Prehľad rôznych typov kmeňových buniek a ich vlastností Kmeňové bunky sú definované na základe dvoch kritérií (Verfaillie et al., 2002): schopnosť sebaobnovy a potenciál rozvinúť sa do rôznych typov buniek. V závislosti od ontogenetického veku sa rozlišuje medzi dvoma typmi kmeňových buniek: embryonálnymi a dospelými kmeňovými bunkami s rôznymi diferenciačnými potenciálmi toti-, pluri-, multi- alebo unipotencie (pozri obrázok 1). Obrázok 1 Typy kmeňových buniek s ich diferenciačným potenciálom Jedna totipotentná kmeňová bunka má neobmedzený diferenciačný potenciál a schopnosť vyvinúť sa do úplného organizmu. Pluripotentné kmeňové bunky

56 reakcií 56 vykazovalo apoptózu. Niektoré gény sa podieľajú na bunkovej proliferácii, väzbe na cytokíny, replikácii DNA, chemotaxii a krvotvorbe (príloha). Tabuľka 10 Vybrané profily expresie upregulovaného génu CD34 + buniek po 10 dňoch kultivácie v médiu StemSpan, v upravenom médiu Gherardi a v upravenom médiu Sautin v porovnaní s nekultivovanými kmeňovými bunkami. Termín Gene no StemSpan-Medium Condi. Gherardi-stredná Kondi. Sautin medium% p Gén č.% P Gén č.% P GO:

bunka% 5,54E% 1,41E-06 proliferácia GO:

mononukleárna %% bunková proliferácia GO:

mitóza% 1,19E% 3,54E% 8,55E-22 GO:

Replikácia DNA %% 5,24E + 10 GO:

bunkový cyklus% 2,16E% 3,23E% 7,13E-16 GO:

apoptóza% 5,56E% 4,75E% GO:

diferenciácia buniek %% GO:

mechanorecept alebo diferenciácia %% GO:

lyzozóm% 6,67E% 1,49E% 3,57E + 02 GO:

57 Výsledky 57 Kmeňové bunky kultivované v kondicionovanom sautínovom médiu exprimovali podobný počet génov ako kmeňové bunky v kondicionovanom médiu Gherardi, 604 nadregulovaných génov a 1126 nadregulovaných génov v porovnaní s nekultivovanými kmeňovými bunkami. Gény patriace do bunkového cyklu, vonkajšie stimuly, hormonálna stimulácia a biosyntéza steroidov boli väčšinou regulované nanovo (príloha). Došlo tiež k akumulácii génov spojených s mikrotubulovo-cytoskeletálnou organizáciou a biogenézou, ako napríklad MID1IP1 a KIF11. Gény zo skupín epidermálny vývoj, fokálna adhézia, zrážanie krvi a krvný obeh sa tiež exprimovali zvýšeným spôsobom. V tomto médiu sa našla väčšina zhlukov s vysokými transkripčnými profilmi pre bunkový cyklus, replikáciu DNA a chromozómy a veľmi málo pre apoptózu. Down-regulované signálne dráhy boli adherenčné spojenie, bunkové adhézne molekuly a signálne dráhy receptora B-buniek. Ďalej boli gény, ktoré patria do jadra, väzba transkripčného faktora, angiogenéza, väzba MHC triedy I a produkcia chemokínov, exprimované menej ako v nekultivovaných kmeňových bunkách. Expresia vybraných génov funkčnej skupiny GO:

58 Výsledky 58 Tabuľka 11 Zmena génovej expresie vybraných génov z databázy GOTERM_BP_ALL a funkčného zoskupenia: GO:

61 Výsledky 61 skoré endodermálne markery, ako je SOX17, sú exprimované po krátkej kultivačnej perióde a neskoršie markery, ako je albumín, sú exprimované na nízkej úrovni v kmeňových bunkách po dlhšej kultivačnej perióde. Tabuľka 12 Spoločná kultivácia kmeňových buniek CD34 + s bunkami AML12. Mrna bola izolovaná v určitých časoch a vybrané gény boli stanovené pomocou semikvantitatívnej RT-PCR (TaqMan). Ukázalo sa, že kokultúra s bunkami AML12 down-reguluje CD34 + bunky down-reguluje génovú expresiu CD34 a endodermálne markery mierne stúpajú. Gen 0d 7d 21d CD SOX FOXA AFP CEBPA HNF4A -/+ -/+ n.a. ALB -/+ -/+ + KRT n.a. KRT n.b. GATA4 - - n.a. CDH n.b. GJB1 -/+ ++ n.a. GJA n.b. KRT n.b. Legenda: qrt-pcr: ++++ CT 0,0-4,0; +++ CT 4,1-8,0; ++ CT 8,1-12,0; + 12,1-16,0;

Ak sa výsledky zvýšili o 64, zvieratá sa ožiarili 1,6 Gy zo zdroja 137 cézia-y. Myši s nulovou hodnotou NOD/SCID/IL2Ry tiež tolerovali túto dávku žiarenia. Týmusové žľazy imunodeficientných NOD/SCID myší boli veľmi malé v porovnaní s imunokompetentnou NMRI myšou ako kontrolou. Taktiež nepreukázali jasné oddelenie drene a kortikálnych zón a boli hypoplastické (obrázok 12). Iba veľmi málo lymfocytov bolo perivaskulárne viditeľných v tkanive týmusu u imunodeficientných testovaných zvierat. Týmus NOD/SCID/IL2Ry nulových myší sa podobal týmusu NOD/SCID myší. a b Obrázok 12 Histopatologické vyšetrenie týmusu imunokompetentnej NMRI myši (a) a imunodeficientnej NOD/SCID myši (b).

66 výsledkov 66 a% HLA-I pozitívnych ľudských buniek (normalizovaných), 7 3,2 3,1 2,2 1,7 1, min. 30 b 80 A 1 A 2 A 3 A 4 60 A1,1 A Priemer AB 1 B 2 20 B 3 B 4 Priemer B 0% ľudské bunky c 20% ľudské bunky Kostná dreň PBS SCF dni po iv aplikácii Slezina PBS SCF dni po iv aplikácii Obrázok 13 Časovo závislý krvný klírens systémovo aplikovaných CD34 + buniek u NOD/SCID myší ( a). 4x105 buniek CD34 + bolo injikovaných i.v. transplantované do ožarovaných myší. Neliečené (plná, modrá čiara) alebo SCF-vopred ošetrené bunky (prerušovaná, červená čiara) sa analyzovali pomocou FACS v myšom krvnom obehu po 1, 5 a 20 minútach po aplikácii. Stanovil sa počet ľudských pozitívnych buniek HLA-I z prijatých buniek. Výsledky sú výsledkom celkových troch experimentov. Dlhodobé prihojenie neošetrených a SCF predošetrených kmeňových buniek u NOD/SCID myší (b, c). Neliečené a SCF vopred ošetrené bunky boli i.v. aplikovaná a kostná dreň (b) a slezina (c) sa analyzujú prietokovou cytometriou s humánnou špecifickou protilátkou HLA-I. Hodnoty sú priemery ± SEM 6-9 myší na skupinu.

88 A b c 2 μm d e s t e c i e 88 a b c 2 um d e Obrázok 27 Expresia pluripotenčných markerov na nediferencovaných kmeňových bunkách SA002. Imunocytometrické stanovenie SSEA-4 (a), TRA-1-60 FITC (b) a okt-4 (d). Nediferencované bunky SA002 na ultraštrukturálnej úrovni (c). Bunky sa vyznačujú veľkým pomerom jadra k plazme (tmavé jadro). Karyogram kmeňových buniek SA002 p41; Giemsova škvrna (e). Opísaný karyotyp 47, XX + 13 sa mohol detegovať pre bunky. Na kontrolu stabilného karyotypu počas dlhodobej kultivácie sa uskutočňovali analýzy karyotypov na línii embryonálnych kmeňových buniek SA002. Analýzu a stanovenie karyogramu uskutočnila spoločnosť IMMD Berlin. Kmeňová bunková línia sa kultivovala pasážou 18 a mechanicky sa konvertovala 23-krát až do prvej analýzy. SA002-