Expresia bunkového inhibítora apoptózového proteínu-2 v ľudskom subkutánnom a

  • abstraktné
  • úvod
  • Metódy
  • Predmety a odber vzoriek
  • Príprava RNA a RT-PCR
  • Izolácia proteínov a analýza Western Blot
  • Detekcia apoptózy
  • Štatistická analýza
  • Výsledky
  • diskusia
  • vďakyvzdania

abstraktné

CIEĽ: V prítomný V tejto štúdii sme sa zaoberali otázkou, či existuje depotne špecifická expresia bunkového inhibítora apoptózového proteínu-2 (cIAP2) už v detstve a či sa relatívna expresia mení s pribúdajúcim vekom so zvyšujúcim sa rizikom viscerálnej obezity.

Predmety: 23 pacientov (12 detí a 11 dospelých) prijaté párové vzorky ľudského tukového tkaniva (OM) a podkožného tukového tkaniva (SC).

METÓDA: Hladiny mRNA cIAP2 sa stanovili pomocou reverznej transkripčnej polymerázovej reťazovej reakcie (RT-PCR) a expresie proteínu sa potvrdila Western blotom. Indexy apoptózy sa stanovili terminálnym značením dUTP fluoresceínu s nick-endom sprostredkovaným deoxynukleotidyl transferázou (TUNEL).

VÝSLEDKY : mRNA cIAP2 bola 1,51-krát vyššia v OM ako v SC tukovom tkanive (OM> SC u 20 z 23 subjektov; P SC u deviatich z 10 subjektov, P 1

Pre obezitu je charakteristické zvýšenie hmotnosti tukového tkaniva. Hmota telesného tuku, najmä akumulácia viscerálneho tuku, úzko súvisí s inzulínovou rezistenciou, kardiovaskulárnymi chorobami, vysokým krvným tlakom a inými závažnými metabolickými poruchami. 2 To ukázalo dôležitosť identifikácie genetických faktorov, ktoré regulujú nielen tukovú hmotu, ale aj jej distribúciu.

Je známe, že omentálne (OM) a subkutánne adipocyty (SC) sa líšia v rôznych metabolických vlastnostiach, ktoré regulujú objem tukových buniek. 3, 4 Zdá sa, že replikácia, diferenciácia a apoptotická odpoveď ľudských tukových buniek sú ovplyvnené anatomickou oblasťou. 5, 6. Distribúciu tukového tkaniva možno preto pripísať miestne špecifickým rozdielom v regulácii týchto procesov. Nedávno sa ukázalo, že regionálne charakteristiky môžu súvisieť s miestne špecifickými rozdielmi v expresii génov, ktoré kódujú dôležité funkčné proteíny. 7 Napríklad expresia leptínu a PPARy y je vyššia v SC ako v OM tukovom tkanive. 8, 9 Naproti tomu je expresia inzulínového receptora (príklad 11-) vyššia v OM ako v SC tukovom tkanive. 9

Inhibítor bunkového apoptózového proteínu-2 (cIAP2) patrí do rodiny proteínov apoptózy (IAPs), ktorá sa podieľa na regulácii apoptózy počas bunkovej proliferácie a diferenciácie. 10, 11, 12 Úloha IAP v ľudskom tukovom tkanive nie je jasná, ale čoraz viac dôkazov naznačuje, že môžu hrať úlohu v regulácii distribúcie telesného tuku moduláciou apoptózy tukových buniek. Jedna správa ukázala, že diferenciácia-závislá expresia proteínu inhibujúceho neuronovú apoptózu (NAIP) v 3T3-L1 adipocytoch môže korelovať s vývojom adipocytovej rezistencie na apoptózu. Dve ďalšie štúdie uviedli, že mRNA cIAP2 je špecificky depotne exprimovaná v tukových bunkách dospelého človeka. 14, 15

Doteraz sa výskum rozdielov v génovej expresii zameriaval na dospelých. Veľmi málo je známe o miestne špecifickej génovej expresii v tukovom tkanive u detí. Pretože existujú rozdiely v hmotnosti a distribúcii v ľudskom tukovom tkanive závislé od veku, zaoberali sme sa otázkou, či existuje expresia cIAP2 špecifická pre dané miesto už v detstve, a ak áno, či sa relatívna expresia mení s pribúdajúcim vekom a či existuje riziko viscerálneho rizika Obezita. V súčasnej štúdii sme preto porovnávali hladiny expresie cIAP2 ako na mRNA, tak na úrovni proteínov v tukovom tkanive OM a SC u detí a dospelých. Ďalej sme skúmali vzťah medzi úrovňou expresie cIAP2 a mierou apoptózy adipocytov, indexom telesnej hmotnosti (BMI) a pohlavím.

Metódy

Predmety a odber vzoriek

Príprava RNA a RT-PCR

Hladiny mRNA cIAP2 sa stanovili u všetkých subjektov, u ktorých bola k dispozícii celková RNA z SC aj OM tukového tkaniva. Celková RNA sa pripravila s použitím činidla TRIzol (Invitrogen Life Technologies, CA, USA) podľa protokolu výrobcu. RNA bola kvantifikovaná spektrofotometricky. Integrita RNA sa overila farbením ribozomálnych RNA pásov etídiumbromidom pomocou 1% agarózového gélu. Získaná RNA bola až do použitia skladovaná pri -70 ° C.

Na analýzu cIAP2 mRNA sa uskutočnila RT-PCR. Celková RNA (0,5 x 1 μg) sa extrahovala 1 hodinu pri 42 ° C v 20 μl pufra obsahujúceho 200 U MMLV reverznej transkriptázy, 0,5 μg oligo d (T) 16, 0,5 mmol/l dNTP, 20 U inhibítor RNázy, reverzne transkribovaný. Vzorky komplementárnej DNA (cDNA) sa denaturovali 5 minút pri 95 ° C a 5 μl cDNA z každej vzorky sa použilo na následnú amplifikáciu PCR v konečnom objeme 50 μl pufra obsahujúceho 2,5 U Taq DNA polymerázy, 0, 2 mmol/L, obsahoval dNTP, 2,5 mmol/L MgCI2 a 0,4 μmol/L každého primeru. Podmienky PCR boli 95 ° C po dobu 5 minút, potom nasledovalo 30 cyklov pri 94 ° C po dobu 30 sekúnd, 60 ° C po dobu 45 sekúnd a 72 ° C po dobu 1 minúty a nakoniec predĺženie o 72 ° C po dobu ďalších 10 minút. Činidlá pre RT dodala Promega Corp. (Madison, USA). Činidlá pre PCR boli od Roche (Mannheim, Nemecko). V tejto semikvantitatívnej RT-PCR boli použité súčasne dve sady primérov (tabuľka 1). Použili sa rôzne počty PCR cyklov, aby sa zabezpečilo, že amplifikácia ako cIAP2, tak p-aktínovej cDNA bola v exponenciálnom rozmedzí. Priméry pre p-aktín sa pridali v šiestom cykle každej PCR amplifikácie.

Po amplifikácii sa 10 p.l. 1 zmesi sa separovalo na 1,5% agarózovom géli zafarbenom etídiumbromidom. Gély sa vizualizovali pod UV svetlom, hustota a pomer cIAP2 k p-aktínu sa merali a analyzovali pomocou kvantifikačného softvéru, verzia 4 Windows a Macintosh (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Izolácia proteínov a analýza Western Blot

Detekcia apoptózy

Apoptotické adipocyty v 15 spárovaných vzorkách sa detegovali terminálnym značením dUTP-fluoresceínovým nick-koncom sprostredkovaným deoxynukleotidyltransferázou (TUNEL) podľa protokolu výrobcu. Apoptotické indexy sa získali spočítaním 200 adipocytov v najmenej štyroch zorných poliach pod svetelným mikroskopom.

Štatistická analýza

Údaje boli analyzované pomocou Štatistického balíka pre spoločenské vedy (SPSS) a hodnote P menšej ako 0,05 bola priradená významnosť. Pretože expresia cIAP2 nebola normálne distribuovaná v tukovom tkanive, je v texte a tabuľke uvedená ako medián (medzikvartilový rozsah). Na porovnanie rozdielov v expresii medzi SC a OM sa použil Wilcoxonov znamienkový test; Na porovnanie špecifických rozdielov medzi deťmi a dospelými sa použil Mann-Whitneyov test. Korelácie sa vypočítali pomocou testu Spearmanovho korelačného koeficientu.

Výsledky

Párové porovnania expresie mRNA cIAP2 z SC a OM tukového tkaniva sa kvantifikovali pomocou RT-PCR, ako je znázornené na obrázku la. Medzi jednotlivcami boli značné rozdiely v úrovni expresie, najmä v OM (1b). Napriek tomu existoval významný depotne špecifický rozdiel v úrovni expresie cIAP2 mRNA (tabuľka 2). mRNA cIAP2 bola 1,51-krát vyššia v OM ako v SC tukovom tkanive (OM> SC u 20 z 23 subjektov; P.

proteínu-2

Depotne špecifické rozdiely v expresii mRNA cIAP2. (a) Príklad analýzy agarózového gélu po RT-PCR spárovaných vzoriek SC a OM tukového tkaniva od piatich jedincov. (b) Scatterplots ukazujú, že expresia mRNA cIAP2 je prítomná v SC a OM tuku od všetkých jednotlivcov. Horizontálne pruhy označujú medián.

Western bloty sú znázornené na obr. V súlade s expresiou mRNA bol obsah proteínu cIAP2 vyšší v OM ako v SC (OM> SC u deviatich z 10 testovaných osôb, P.

proteínu-2

Depotne špecifické rozdiely v expresii proteínu cIAP2. (a) Príklad imunoblotov cIAP2 proteínov z SC a OM tukového tkaniva od štyroch jedincov. (b) Rozptyly ukazujú expresiu proteínu cIAP2 v SC a OM tuku od 10 jedincov. Horizontálne pruhy označujú medián.

Imunohistochemická analýza nepreukázala žiadny rozdiel medzi SC a OM v apoptotických indexoch adipocytov (apoptotické indexy 14, ktoré vykazovali vyššiu expresiu mRNA cIAP2 v OM ako SC adipocyty dospelých. Rovnakí autori tiež preukázali, že expresia mRNA cIAP2 v ľudských predeadipocytoch OM je vyššia ako v SC tuku.15 Ich štúdia sa však zamerala iba na hladiny mRNA. Pretože expresia mRNA nie vždy odráža expresiu proteínu alebo koncentráciu plne spracovaného proteínu, pozorovanie sme rozšírili pridaním potvrdili sme, že hlavný rozdiel medzi OM a SC tukovým tkanivom sa vyskytuje aj na úrovni bielkovín.

CIAP2 bol pôvodne identifikovaný ako proteín spojený so signálnym komplexom receptora TNF-a, čo naznačuje, že môže byť zapojený do regulácie signalizácie TNF-a. 16 Nadexpresia ľudského proteínu cIAP2 môže potlačiť bunkovú smrť vyvolanú rôznymi stimulmi. V porovnaní s ľudskými izolovanými adipocytmi majú preadipocyty kultivované v médiu obsahujúcom sérum vyššie hladiny mRNA cIAP2 a tiež nižšiu citlivosť na apoptózu indukovanú TNF-a. 14, 15, 17 Preto môže expresia cIAP2 v SC a OM tukovom tkanive odrážať depotne špecifickú citlivosť na apoptózu a tým spôsobiť stratu alebo ukladanie tukového tkaniva.

V tejto štúdii sme nezistili žiadny rozdiel v miere bazálnej apoptózy medzi adipocytmi z dvoch zásob. Pravdepodobným vysvetlením je, že bazálne apoptotické indexy boli príliš nízke na to, aby sa dali presne kvantifikovať a porovnať. Tento názor podporuje skutočnosť, že Prins a kol. 17 ukázal, že bazálny apoptotický index tukových buniek kultivovaných v médiu obsahujúcom sérum bol veľmi nízky bez ohľadu na použitú metódu. 6 Nemôžeme však vylúčiť, že použitá metóda je príliš necitlivá na zistenie rozdielu v indexoch apoptózy medzi dvoma miestami v tukovom tkanive, čo by mohlo korelovať s rozdielom v expresii cIAP2. Okrem toho je ešte potrebné preskúmať fyziologickú úlohu miestne špecifického rozdielu expresie v cIAP2 v tukovom tkanive.

V súhrne sme porovnali expresiu mRNA cIAP2 v SC a OM tukovom tkanive u 12 detí a 11 dospelých. Vyššia relatívna expresia v OM v porovnaní s SC tukovým tkanivom sa zistila u detí a dospelých. To naznačuje, že rozdielna expresia cIAP2 medzi depotmi môže byť spôsobená inherentnými vlastnosťami buniek z dvoch depotov. Výraznejší rozdiel špecifický pre depot u detí by mohol odrážať čistý prírastok viscerálneho tukového tkaniva počas rastu.

vďakyvzdania

Túto prácu podporili Fond pre vedecký výskum výboru Jiangsu (99KJD 320012) a Švédska rada pre lekársky výskum (19X-05708). Ďakujeme pánom Xu Xiaoqun, Lou Louo, Chen Yijiang a prof. Petrovi Naredimu za poskytnutie vzoriek tukového tkaniva pre tieto štúdie a profesorovi Tommymu Olssonovi za plodné diskusie.