FÁZA 1

KOMPLEXNÝ SYSTÉM NA ZISTENIE NIEKTORÝCH LIEKOVÝCH LÁTOK
HORMONÁLNY A XENOESTROGÉN, V NANOSKÁLNOM, VO VODNÝCH ZDROJOCH

detekčné limity

FÁZA 1

VI. závery

  • V tejto etape sa aktivity zamerali hlavne na prezentáciu hlavných látok s endokrinným účinkom a estrogénových steroidných hormónov.
  • Bol vykonaný prehľad analytických techník použitých na stanovenie, menovite: ▪ odber vzoriek a príprava vzoriek životného prostredia; ▪extrakcie; ▪koncentrácia, ▪ izolácia a čistenie, ako aj ▪ stanovenie GC/MS
  • Ďalší smer štúdie sa zameral na in vitro testovacie systémy pre estrogénny účinok chemických zlúčenín, menovite: ▪imunologické stanovenia; ▪ biologické stanovenia na základe receptorov, ▪ sprievodca bioaktivitou pre frakcionáciu a analýzu; ▪zabezpečenie kvality pre analýzy EAS
  • Príspevok predstavuje najpoužívanejšie metódy analýzy endokrinných účinných látok: ▪organochlórované insekticídy; ▪polychlórované a polybrómované bifenyly (PCB, PBB), ▪dioxín a podobné zlúčeniny, polybrómované difenylétery (PBDE); ▪alkylfenoly, alkylfenolové etoxyláty, ftaláty; ▪organické zlúčeniny ▪ steroidné hormóny ▪ fytoestrogény
  • In vitro testovacie stratégie na estrogénny účinok chemických zlúčenín sa používajú na vyšetrenie potravín, vzoriek životného prostredia a na vedenie špecifickej inštrumentálnej analýzy na frakcionáciu zložiek a potvrdenie štruktúry.
  • Napriek výhodám biologických hodnotení budú chemické látky stále potrebné pre základný výskum zameraný na identifikáciu a porozumenie pôsobenia niektorých látok, na hospodárenie s chemickými látkami a na ich zmierňovanie.
  • Medzi látky podozrivé z významného vplyvu na ľudský reprodukčný systém patria bifenyly, diben-zodioxíny, dibenzofurány, DDT. Počet potenciálnych látok sa odhaduje na niekoľko stoviek. Sú to hlavne fenoly a bisfenoly. Ale aj aromatické látky, ktoré neobsahujú fenolové skupiny, môžu prechádzať metabolizmom na fenoly, napríklad metoxychlórové deriváty, polychlórbenzén, ktorý môže pôsobiť estrogénimeticky. Existujú aj látky, ktoré nemajú aromatickú štruktúru a sú aktívne (Endosulfan, Dieldrin, Kepon, Toxaphen).
  • Chemické aj biologické analýzy sú teda mechanizmom na pochopenie rizika, ktoré predstavujú niektoré chemikálie v komplexných zmesiach prírodných alebo antropogénnych kontaminantov.
  • Niektoré úvahy z preskúmania týchto údajov z budúcich výskumných materiálov zahŕňajú [1]:
  • priorita pre štúdium kontaminovaných oblastí, liečebných procesov, bioakumulácie zmesí POPs u cicavcov a EAS prostredníctvom ľudskej stravy.
  • lepšia integrácia testovacích metód pre rôzne triedy EAS.
  • niekoľko automatických a selektívnych extrakčných a koncentračných postupov a techník (napr. imunoafinitné kolóny)
  • metódy musia tiež obsahovať metabolity xenobiotík ako potenciálne EAS,
  • zvýšenie používania metód LC/MS na úkor metód založených na GC/MS, ktoré si vyžadujú derivatizáciu. To si bude vyžadovať lepšiu techniku ​​potvrdzovania štruktúry ako tandemová hmotnostná spektrometria a pravdepodobne väčšie použitie izotopovo značených zlúčenín ako vnútorných štandardov na korekciu účinkov matice.
  • vývoj bioanalytických nástrojov, v ktorých je separácia, spektroskopia a biologická detekcia spojené s cieľom poskytnúť informácie o chemických účinkoch a vlastnostiach vrátane
  • kvantitatívne korelácie medzi bioodpoveďou a chemickými údajmi sú výkonnými nástrojmi, ale vyžadujú si vyhradené úvahy pre pôsobenie rušivých faktorov.
  • väčšie dodržiavanie zásad zabezpečenia kvality, pokiaľ ide o validáciu metód, opätovné overenie výkonu, rekalibráciu, potvrdzovacie testy a medzilaboratórne štúdie.

FÁZA 2

V. Závery

Xenobiotiká zahŕňajú širokú škálu chemických štruktúr s estrogénnymi vlastnosťami uvedenými v prvej výskumnej správe. Táto rozmanitosť sťažuje predvídanie estrogénnosti xenobiotík iba na základe štruktúry.

Existujúce estrogénové látky v životnom prostredí sú ľudia a zvieratá eliminované buď v prirodzenom stave, alebo vo forme estrogénových derivátov kyselín a glukurónových kyselín.

Účelom tohto kroku je predstaviť, prispôsobiť a vyvinúť a optimalizovať pre súčasné použitie kombináciu analytickej a biologickej metódy. .

Biologická metóda a skúška in vitro na detekciu estrogénnych látok sa spojí s chromatografiou na tenkej vrstve (HPTLC).

Biologický test známy ako Sumpterov test mal byť modifikovaný na úrovni pôsobenia na chromatografickú doštičku za podmienok jej predchádzajúceho kondicionovania. V tomto zmysle budú doštičky obsahovať vrstvu kvasinkových buniek v lyofilizovanej fáze kondicionovanej kopolymérom a iónmi medi, najlepšie z octanu.

Cieľom je mať po ruke skríningový test zloženia a izolovaných látok kedykoľvek prístupný bez potreby dosiahnutia optimálneho okamihu vývoja kvasinkovej kultúry. Testy sa teraz uskutočňujú buď ponorením alebo postriekaním vzorky, ktorá sa má skúmať, kvasinkovou kultúrou v priaznivom štádiu vývoja. Preto často protichodné výsledky a nedostatok reprodukovateľnosti, najmä pri kvantitatívnych stanoveních.

Vysokoúčinná chromatografia na tenkej vrstve tiež umožňuje vyhodnotiť elučné metódy v súlade s vlastnosťami látok, ktoré sa majú separovať, s dobrou reprodukovateľnosťou. Pevné podpery majú veľkú rozmanitosť, takže je možné pokryť širokú škálu možností.

Látky môžu byť konzervované na chromatografickej doske, čo umožňuje použitie ďalších detekčných metód FT-IR, RES podľa metód vyvinutých v iných aplikáciách v rámci nášho tímu.

Pomocou hmotnostnej spektrometrie a nukleárnej magnetickej rezonancie sepot prináša po správnom spracovaní dôkaz o štrukturálnej identifikácii látok s endokrinným účinkom.

V budúcnosti bude po kombinácii tohto chromatografického testu s autobiografickou detekciou nasledovať susedný test vitality, ktorý bude schopný poskytnúť informácie týkajúce sa cytotoxicity skúmaných látok.
Prostredníctvom tohto testu sa získajú informácie týkajúce sa množstva, identity a cytotoxického biologického pôsobenia látok alebo zložiek v skúmaných zmesiach.

Pretože rastová fáza, v ktorej sa nachádzajú kvasinkové bunky, je dôležitým parametrom, odporúča sa pre každý experiment zvýšiť krivku rastu kultúry. Keď sa bunky uložia na chromatografickú platňu, musia byť vo fáze rozmnožovania bezprostredne pred fázou exponenciálneho rastu.
Po asi 5 hodinách inkubácie na platni bunky dosiahli fázu exponenciálneho rastu.
Korelácia medzi optickou hustotou a logaritmom počtu buniek je lineárna až do optickej hustoty 1,2. Potom je možné získať pre rovnaký počet buniek rôznu optickú hustotu, preto by inkubácia a vývoj kultúry nemali presiahnuť DOmax = 1,2

Optimalizácia testu sa musí vykonať optimalizáciou každého parametra zvlášť.
Nastriekanie dlaždíc viedlo k diferencovanému zvlhčeniu použitého obkladu silikagélom.
Výhodnejšie je ponorenie dosiek, pretože to zaisťuje rovnomerné zvlhčenie.

Depozícia sa testovala pomocou kopolyméru Ndiizopropylakrylamidu s kyselinou akrylovou v rôznych pomeroch monomérov, aby sa zmenila viskozita a zlepšili sa charakteristiky adsorpcie a stability kvasníc.
Dodatočná impregnácia roztokom octanu meďnatého sa uskutočnila s cieľom umožniť v budúcnosti vykonávanie niektorých meracích testov elektronickou spinovou rezonanciou, čo umožní získať v rámci testu určité informácie o miestnej dynamike a formách komplexácie.
Aby sa zabránilo nesprávnym interpretáciám v dôsledku toxicity niektorých rozpúšťadiel, boli testované rozpúšťadlá a zmesi rozpúšťadiel použitých na elúciu alebo extrakciu vzoriek. Z nich toluén a DMFA vykazovali toxicitu pre kvasinkovú kultúru. Aby sa zabránilo použitiu niektorých organických rozpúšťadiel pri elúcii a aby sa lepšie pripravili chromatografické doštičky na inkubáciu, rozšíria sa výsledky testov na chromatografických doštičkách s reverznou fázou. (RP-18W F254). V tejto situácii je možné elúciu uskutočniť vo vodnom prostredí, v tlmivých roztokoch.

Ďalej bude vypracovaný protokol na separáciu látok vo vzorkách skutočnej vody na univerzálne použitie, a to ako pre vodu s vysokým obsahom anorganickej povahy, ťažké kovy, tak aj pre vodu so zvýšeným obsahom organickej povahy. Prevažovať bude predovšetkým v smere povrchových vôd, jednak zdrojov údržby podzemnej vody pre zásobovanie vodou, jednak priamych zdrojov pitnej vody, organického zloženia do vodovodnej vody, upravovaných chloráciou.

Estrón (E1) a Estriol (E3) bolo možné detegovať až do koncentrácií 10 µg/l (E1) a 2 mg/l, bisfenol-A (Bis-A)> 30 mg/l priamou aplikáciou na podložku chromatografické bez spracovania vzorky.

Použitím adsorpčných náplní možno detekčné limity podstatne znížiť približne o 103 - 106 krát.
Kalibráciou ich retenčnej kapacity bude možné vykonať kvantitatívne odhady týkajúce sa úrovne detegovaného xeno- a estrogénu.

Test je užitočný pri skríningu rôznych vodných zdrojov na kvalitatívnu identifikáciu prítomnosti xenoestrogénov.

Odpadové vody budú cieľom v nasledujúcich fázach, kde sa budú študovať hlavne možnosti ich čistenia.

Konzervácia vzoriek je dôležitá, pretože stabilita estrogénu je obmedzená vo väčšine environmentálnych situácií, ako sú napríklad odpadové vody. Príprava vzorky je často veľmi nepohodlná a na druhej strane je pri výbere analytických testovacích metód dôležitá kvalita čistenia vzorky. Estrogénové steroidy sú do istej miery vylučované vo forme zlúčenín, a to ako u ľudí, tak aj u zvierat. Hodnotenie metabolitov a degradačných zlúčenín je aktuálnou témou metabolomického výskumu na celom svete.

V literatúre sa odporúča niekoľko metód analytického stanovenia na analýzu estrogénu v prostredí.

Metódy založené na UV, GC-FID alebo HPLC technikách sa neodporúčajú kvôli nízkej citlivosti a selektivite.

Jednostupňová hmotnostná spektrografová chromatografia (GC-MS alebo LC-MS) a použitie imunochemických techník sú minimálnymi metódami požadovanými na zabezpečenie spoľahlivých výsledkov. Je vidieť, že GC-MS aj LC-MS sa používajú aj v prípade komplexného stanovenia pre hodnoty LOD = 0,3 -5 ng/l.

Odporúčanými technikami charakterizácie štruktúrneho estrogénu sú LC-MS-MS alebo GC-MS-MS a NMR na vysoko citlivých jadrových sondách prispôsobených na malé množstvá, ktoré je možné izolovať, pričom vykazujú citlivosť a citlivosť od 0,1 ng/l (LOD = 0,1 ng/l). Priame metódy s detekčnými limitmi nižšími ako 0,1 ng/l obsahu estrogénu ešte nie sú komerčne dostupné. Tieto vzorky je však možné vyhodnotiť, pretože zahŕňajú niekoľko fáz výskumu pri príprave vzoriek, pravdepodobne s použitím prístrojov na analýzu triple-quadrupole.

Imunochemické metódy sú tiež veľmi citlivé (pre detekčné limity LOD = 0,05 - 850 ng/l) minimálne pre analýzu vzoriek odpadových vôd a odpadových vôd z úpravní vôd, ale selektivita je nízka v porovnaní s prístrojmi ako napr. triple-quadrupole. Imunochemické metódy tiež spôsobujú problémy spojené s nízkou selektivitou a interferenciami produkovanými inými zlúčeninami prítomnými vo vzorkách podrobených analýze. Z dôvodu týchto obmedzení sa imunochemické metódy samy osebe neodporúčajú ako analytická metóda, musia sa však duplikovať alebo kombinovať pomocou starostlivo zvolenej stratégie s stanovením LC-MS-MS alebo GC-MS-MS alebo dokonca s „jednoduchými“ metódami. " VĎAKA.

KROK 3

VI. závery

KROK 4

V. ZÁVERY