Funkčné štúdie

Zvládanie: Prof. Dr. Martin Klingenspor
Ústav: Molekulárna výživová medicína, Technická univerzita v Mníchove, Inštitút Else Kröner-Fresenius a Ústredný inštitút pre výskum výživy a potravín
Domovská stránka: www.molekulare-ernaehrungsmedizin.de/

Cieľom IG „Molekulárne mechanizmy obezity“ je identifikovať gény a alely, ktoré predisponujú jednotlivcov k rozvoju obezity, a overiť ich z hľadiska epidemiológie, funkcie, klinického významu a terapeutických dôsledkov.

funkčné

Na bunkovej úrovni sa uskutočňovali funkčné štúdie v kultivovaných ľudských tukových bunkách s cieľom identifikovať úlohu vybraných kandidátskych génov pre metabolizmus lipidov a glukózy a mitochondriálne funkcie (Wabitsch). Na tento účel boli konštrukty shRNA navrhnuté proti zodpovedajúcim génom, klonované do vstupných vektorov a potom zavedené do ľudských tukových buniek pomocou lentivírusových vektorov. Je zaujímavé, že v FTO-deficitných adipocytoch bola expresia markera pre hnedé tukové tkanivo - UCP-1 (odpojujúci proteín-1) zvýšená asi 4-násobne na úrovni RNA a proteínu. Funkčne to viedlo k zvýšenému bazálnemu a oddelenému dýchaniu v FTO-deficitných adipocytoch. V depotoch bieleho tukového tkaniva myší s deficitom Fto sme boli schopní detegovať zvýšený počet Ucp-1-pozitívnych adipocytov a zvýšenú expresiu mRNA tohto markera v porovnaní s kontrolami divokého typu (6).

Na molekulárnej úrovni sa kandidátsky gén FTO podrobne skúmal s ohľadom na funkciu proteínu FTO na reguláciu génovej expresie a na spracovanie RNA v ľudskej bunkovej línii a u myší s knockoutom FTO (Horsthemke). Po nadmernej expresii FTO vykazovalo 95% všetkých mRNA zmenených v dávke zvýšené hladiny. Väčšina modifikovaných transkriptov kóduje proteíny, ktoré sa podieľajú na zostrihu RNA a metabolizme RNA. To zapadá do lokalizácie FTO v jadrových škvrnách. Po vyčerpaní FTO vykazovalo 78% všetkých mRNA zmenených v dávke znížené hladiny. Tu boli viditeľné transkripty kódujúce proteíny, ktoré sa podieľajú na bunkovej reakcii na nedostatok živín. Znížila sa tiež MALAT1 RNA, ktorá sa nachádza v jadrových škvrnách. Prvýkrát sa u myší s deficitom Fto ukázalo, že FTO ovplyvňuje obsah 3-metyl-uridínu a pseudouridínu v nemRNA (7).

Melanokortínová signálna dráha hrá dôležitú úlohu pri regulácii hmotnosti. Preto sme analyzovali metylačný profil DNA génu proopiomelanokortínu (POMC). Pozorovali sme významnú hypermetyláciu na ostrove POMC 3´CpG u detí s nadváhou v porovnaní s deťmi s normálnou hmotnosťou. Tento hypermetylačný variant existoval ešte predtým, ako sa vyvinula obezita, a viedol k zníženej expresii POMC mRNA, ktorá bola čiastočne sprostredkovaná zníženou väzobnou kapacitou komplexu P300. Nakoniec sme pozorovali, že metylačný profil POMC DNA je spojený s prítomnosťou špecifických Alu prvkov. Z toho vyvodzujeme záver, že tento variant hypermetylácie POMC ako „epigenomický podpis“ vedie k zvýšenému riziku vzniku obezity v priebehu života.

Pri skúmaní nezmyslov mutácií MC4R sme mohli po prvýkrát preukázať, že in vitro je možné preskočenie sprostredkované aminoglykozidmi a vedie k funkčným receptorom (8). Ďalej sme boli schopní ukázať, že štartovací kodón MC3R nie je v polohe opísanej doteraz, ale v polohe zodpovedajúcej myši. To znamená, že MC3R-SNP (T6K) nie je v kódujúcej oblasti receptora.

Vybrané publikácie
1. Bolze F, Rink N, Brumm H, Kuhn R, Mocek S, Schwarz AE, Kless C, Biebermann H, Wurst W, Rozman J a Klingenspor M. Charakterizácia nezmyselnej mutácie melanokortín-4-receptora W16X in vitro a in vivo. Pharmacogenomics J. 2013; 13 (1): 80-93.
2. Nordstrom V, Willershauser M, Herzer S, Rozman J, von Bohlen Und Halbach O, Meldner S, Rothermel U, Kaden S, Roth FC, Waldeck C, Gretz N, de Angelis MH, Draguhn A, Klingenspor M, Grone HJ a Jennemann R. Neuronálna expresia glukozylceramid syntázy v centrálnom nervovom systéme reguluje telesnú hmotnosť a energetickú homeostázu. PLoS Biol. 2013; 11 (3): e1001506.
3. Vegiopoulos A, Muller-Decker K, Strzoda D, Schmitt I, Chichelnitskiy E, Ostertag A, Berriel DM, Rozman J, Hrabe de AM, Nusing RM, Meyer CW, Wahli W, Klingenspor M a Herzig S. Cyclooxygenase- 2 riadi energetickú homeostázu u myší de novo prijímaním hnedých adipocytov. Veda. 2010; 328 (5982): 1158-1161.
4. Khasawneh J, Schulz MD, Walch A, Rozman J, Hrabe de Angelis M, Klingenspor M, Buck A, Schwaiger M, Saur D, Schmid RM, Kloppel G, Sipos B, Greten FR a Arkan MC. Zápal a beta-oxidácia mastných kyselín mitochondrií spájajú obezitu s včasnou podporou nádoru. Proc Natl Acad Sci USA. 2009; 106 (9): 3354-3359.
5. Volckmar AL, Bolze F, Jarick I, Knoll N, Scherag A, Reinehr T, Illig T, Grallert H, Wichmann HE, Wiegand S, Biebermann H, Krude H, Fischer-Posovszky P, Rief W, Wabitsch M, Klingenspor M, Hebebrand J a Hinney A. Mutačný skríning v géne pre obezitu odvodenom od GWAS SH2B1 vrátane funkčných analýz detegovaných variantov. BMC Med Genomics. 2012; 5 (65.
6. Tews D, Fischer-Posovszky P, Fromme T, Klingenspor M, Fischer J, Ruther U, Marienfeld R, Barth T, Moller P, Debatin K a Wabitsch M. Nedostatok FTO indukuje expresiu UCP-1 a mitochondriálne odpojenie v adipocytoch . Endokrinológia. 2013.
7. Berulava T, Ziehe M, Klein-Hitpass L, Mladenov E, Thomale J, Ruther U a Horsthemke B. Úrovne FTO ovplyvňujú modifikáciu RNA a transkriptóm. Eur J Hum Genet. 2013; 21 (3): 317-323.
8. Brumm H, Muhlhaus J, Bolze F, Scherag S, Hinney A, Hebebrand J, Wiegand S, Klingenspor M, Gruters A, Krude H a Biebermann H. Záchrana nezmyslových mutácií sprostredkovaných receptorom melanokortínu 4 (MC4R) aminoglykozidmi sprostredkovanými read-through. Obezita (strieborná jar). 2012; 20 (5): 1074-1081.