Gény
Jürgen Markl
12 Inštitút pre molekulárnu fyziológiu, Univerzita Johannesa Gutenberga, Mainz, Nemecko
David Sadava
13 Keck Science Center, Claremont, CA, USA
David M. Hillis
14 The University of Texas at Austin, Austin, TX, USA
H. Craig Heller
15 Stanford University, Stanford, CA, USA
Sally D. Hacker
16 Oregonská štátna univerzita, Corvallis, OR, USA
Andreas Held
Birgit Jarosch
7 Jarsoch Text, Aachen, Severné Porýnie-Vestfálsko, Nemecko
Lothar Seidler
Monika Niehaus-Osterloh
Eva Sixt
10 Mníchov, Bayern Nemecko
Matthias Delbrück
Fascination Research: The Dog Genome Project
Canis lupus familiaris, domáci pes, si ľudia domestikovali asi pred 15 000 rokmi. Aj keď existuje veľa rôznych druhov vlkov, sú si dosť podobné, ale to nie je prípad „najlepšieho priateľa človeka“. Fédération Cynologique Internationale (FCI), najväčšia strešná organizácia pre chovateľov psov, uznáva viac ako 300 plemien psov. Genetici predpokladajú okolo 100 skutočných plemien psov, zvyšok tvoria odrody. Nielen, že plemená psov vyzerajú celkom odlišne, ale veľmi sa líšia aj výškou. Napríklad priemerná čivava váži iba 1,5 kg, zatiaľ čo škótsky chrt váži 70 kg. Žiadny iný cicavec nevykazuje takú veľkú fenotypovú variabilitu. U psov existujú tiež stovky genetických chorôb a mnohé z nich majú svoje náprotivky u ľudí. Projekt psieho genómu sa začal koncom 90. rokov 20. storočia s cieľom zistiť, ktoré gény sú zodpovedné za genetickú variabilitu a súvislosti medzi génmi a chorobami.
Fascination Research: The Dog Genome Project
Canis lupus familiaris, domáci pes, si ľudia domestikovali asi pred 15 000 rokmi. Aj keď existuje veľa rôznych druhov vlkov, sú si celkom podobné, ale to nie je prípad „najlepšieho priateľa človeka“. Fédération Cynologique Internationale (FCI), najväčšia strešná organizácia pre chovateľov psov, uznáva viac ako 300 plemien psov. Genetici predpokladajú, že existuje okolo 100 skutočných plemien psov, zvyšok tvoria odrody. Nielen, že plemená psov vyzerajú celkom odlišne, ale veľmi sa líšia aj výškou. Napríklad priemerná čivava váži iba 1,5 kg, zatiaľ čo škótsky chrt váži 70 kg. Žiadny iný cicavec nevykazuje takú veľkú fenotypovú variabilitu. U psov existujú tiež stovky genetických chorôb a mnohé z nich majú svoje náprotivky u ľudí. Projekt psieho genómu sa začal koncom 90. rokov 20. storočia s cieľom zistiť, ktoré gény sú zodpovedné za genetickú variabilitu a súvislosti medzi génmi a chorobami.
Prvými dvoma psami, ktoré mali svoje genómy úplne zoradené, boli boxer a pudel. DNA psieho genómu obsahuje 2,8 miliárd párov báz v 39 pároch chromozómov. Obsahuje 19 000 génov kódujúcich bielkoviny, z ktorých väčšina má obdobu u iných cicavcov vrátane ľudí. Pomocou kompletnej sekvencie genómu začali mapovať genetické markery - špecifické krátke sekvencie DNA - na určitých pozíciách v genóme, ktoré sa líšia u jednotlivých psov alebo plemien psov.
Genetické markery slúžia na lokalizáciu (a teda identifikáciu) génov, ktoré riadia určité vlastnosti. Napríklad Elaine Ostrander a jej výskumná skupina študujú portugalských vodných psov, aby identifikovali gény, ktoré kontrolujú veľkosť tela. Odstránenie buniek na izoláciu DNA bolo pomerne ľahké: vatovým tampónom ste prešli po vnútornej strane líca. Gén pre inzulínový rastový faktor 1 (IGF-1) sa ukázal ako dôležitý pri určovaní výšky: veľké plemená majú alelu, ktorá kóduje aktívny IGF-1, zatiaľ čo malé plemená majú alelu niesť alelu pre menej aktívny IGF-1.
Podľa očakávania niektorí vedci založili spoločnosti, ktoré testovali psy na genetické varianty na základe DNA, a tým potvrdili „čistotu plemena“ dotknutým majiteľom psov. Podobne sa sekvenoval genóm domácich mačiek, divých mačiek a rôznych druhov veľkých mačiek. Porovnania týchto živočíšnych genómov pomáhajú určiť evolučnú históriu rôznych línií cicavcov a tiež identifikovať gény zodpovedné za choroby a formy znakov, ktoré sa vyskytujú u rôznych druhov cicavcov. Takéto výskumy sa samozrejme neobmedzujú iba na cicavce, ale v živočíšnej ríši existujú genómové projekty vrátane rastlín, húb, mnohých ďalších eukaryotov a mnohých prokaryotov.
Aké vedomosti sme získali sekvenovaním genómov zvierat?
Odpovede na túto otázku nájdete v časti „Experiment: Komparatívna analýza tigrového genómu“ v kapitole 17.1 a vo časti „Fascination Research“ na konci tejto kapitoly.
Gény je možné teraz sekvenovať veľmi rýchlo
V Sekvenovanie genómu je určená nukleotidová sekvencia celého genómu živej bytosti. U prokaryota, ktorý má jediný chromozóm, je sekvencia genómu kontinuálna sekvencia párov báz (bp). V diploidných, sexuálne sa množiacich druhoch s viacerými autozómami a dvojicou pohlavných chromozómov (oddiel 10.1007/978-3-662-58172-8_12 # Sec22) termín „sekvenovaný genóm“ obvykle označuje sekvenciu všetkých báz v haploide Sada autozómov a dva pohlavné chromozómy (u ľudí 22 + 2, u psov 38 + 2).
Stručne
Gény sú sekvenované vo forme krátkych fragmentov, ktoré sú navzájom mapované pomocou presahov.
Vo funkčnej genomike sa sekvenčné informácie používajú na stanovenie funkcií rôznych častí genómu.
V komparatívnej genomike sa porovnávajú genómové sekvencie rôznych organizmov.
S pokrokom v technológii sekvenovania DNA došlo k explózii genetickej informácie, ktorú môžu vedci využiť rôznymi spôsobmi.
Jeden môže porovnať genómy rôznych druhov a zistiť, ako sa líšia na úrovni DNA. Tieto informácie možno potom použiť na pochopenie evolučných vzťahov.
Dá sa porovnať sekvencie jednotlivcov v rámci druhu, aby sa identifikovali mutácie, ktoré spôsobujú konkrétne fenotypy.
Informácie o sekvencii je možné použiť na identifikáciu génov pre určité typy znakov, ako sú napríklad gény spojené s chorobami.
Možno nájsť DNA sekvenciu génov kódujúcich proteíny a z toho odvodiť aminokyselinovú sekvenciu príslušných proteínov, pokiaľ táto nie je známa.
Sekvenciu báz krátkeho fragmentu DNA je možné určiť rýchlo
Schopnosť sekvenovať celý genóm zložitého organizmu sa neuvažovala ani pred rokom 1986. Laureát Nobelovej ceny Renato Dulbecco a ďalší vedci však v tom čase navrhli, že by sa mala mobilizovať vedecká komunita na celom svete s cieľom zaoberať sa sekvenovaním celého ľudského genómu. Jedným z dôvodov bolo, že ľudia, ktorí prežili atómové bombardovanie v Japonsku počas druhej svetovej vojny a ktorí boli vystavení žiareniu, by mali byť vyšetrení na možné poškodenie DNA. Aby však bolo možné určiť zmeny v ľudskom genóme, musela byť najskôr známa jeho sekvencia.
Bolo to teda financované z verejných peňazí Projekt ľudského genómu zahájený, obrovský podnik, ktorý bol úspešne dokončený v roku 2003 - podstatne skôr, ako sa očakávalo. Tieto snahy podporili a doplnili skupiny financované zo súkromných zdrojov. Prínosom pre projekt bol vývoj mnohých nových a priekopníckych metód, ktoré sa najskôr použili na sekvenovanie menších genómov - od prokaryotov a jednoducho vytvorených eukaryotov, ako sú napríklad modelové organizmy, s ktorými ste sa stretli v predchádzajúcich kapitolách tejto knihy. Mnoho z týchto metód je dnes široko používaných, vrátane úplne nových metód špeciálne pre sekvenovanie genómu. Metodický vývoj v tomto sektore pokračuje. Tieto metódy sú doplnené novými metódami na štúdium fenotypovej diverzity proteínov a metabolických produktov v bunke. Základnou požiadavkou bol a je dramatický ďalší vývoj počítačového hardvéru a softvéru, aby bolo možné zvládnuť obrovské množstvo údajov, ktoré vznikajú.
Mnoho prokaryotov má jeden chromozóm, zatiaľ čo eukaryoty majú veľa chromozómov. Chromozómy možno vďaka svojej rozdielnej veľkosti od seba ľahko oddeliť. Najpriamejšou metódou sa javí začať sekvenovať chromozóm na jednom konci a jednoducho sekvenovať celú molekulu DNA, nukleotid po nukleotide. Úlohu do istej miery zjednodušuje skutočnosť, že musí byť radená iba jedna z dvoch vetiev, pretože druhá sa vzájomne dopĺňa. Pozrite sa na postupnosť
potom musí druhý reťazec vyzerať takto:
Avšak ani pri dnešných metódach nie je možné a tiež potrebné sekvenovať molekulu DNA, ktorá má dĺžku párov báz od jedného konca k druhému. Vďaka tejto stratégii je možné naraz sekvenovať najviac niekoľko tisíc párov báz. Aby bolo možné určiť sekvenciu genómu, musí sa niekoľko centimetrov dlhé vlákno DNA chromozómu rozdeliť na veľa krátkych fragmentov DNA a potom sa súčasne sekvenujú tisíce takýchto fragmentov.
V 70. rokoch minulého storočia vynašiel Frederick Sanger a jeho spolupracovníci metódu, pomocou ktorej je možné sekvenovať DNA pomocou chemicky modifikovaných nukleotidov. Tieto nukleotidy boli pôvodne určené na zastavenie delenia rakovinových buniek. Táto metóda (alebo jej variant) sa použila na stanovenie prvej sekvencie genómu ľudí a niekoľkých modelových organizmov. Podľa dnešných štandardov je však metóda pomerne pomalá, nákladná a náročná na prácu. V prvom desaťročí nového tisícročia sa vyvinuli rýchlejšie a lacnejšie metódy, ktoré sa často označujú ako Vysoko výkonné sekvenovanie zhŕňa. Tieto metódy využívajú miniaturizovanú techniku pôvodne vyvinutú pre elektronický priemysel a mechanizmy replikácie DNA, často v kombinácii s Polymerická reťazová reakcia (PCR).
Krížová referencia
PCR môže byť automatizovaná; je to dôležitá metóda na sekvenovanie malého množstva DNA. Podrobnosti o PCR nájdete v časti 10.1007/978-3-662-58172-8_13 # Sec23.
Pod pojmom sú zhrnuté aj metódy vysoko výkonného sekvenovania Sekvenovanie novej generácie (NGS) sa rýchlo zdokonaľujú. Jeden z mnohých prístupov je tu načrtnutý a je znázornený na obrázku 17.1. Najskôr sa fragmenty DNA pripravia na sekvenovanie ich naviazaním na pevný podklad a amplifikáciou DNA pomocou PCR (obr. 17.1 a):
Veľká molekula DNA je rozdelená na krátke fragmenty, každý s veľkosťou asi 100 bp. To sa dá dosiahnuť fyzicky vytvorením mechanických šmykových síl, ktoré zlomia DNA. Alebo sa používajú enzýmy, ktoré v určitých intervaloch hydrolyzujú fosfodiesterové väzby medzi nukleotidmi v hlavnom reťazci DNA.
DNA je denaturovaná teplom, čím sa rozbijú vodíkové väzby, ktoré držia dva reťazce pohromade. Každý jednotlivý reťazec potom slúži ako templát pre syntézu novej, komplementárnej DNA.
Na konce každého fragmentu sú pripojené krátke syntetické oligonukleotidy, ktoré sú naviazané na pevný nosič.
Fragmenty DNA sa amplifikujú pomocou PCR. Používajú sa primery, ktoré sú komplementárne k syntetickým oligonukleotidom na koncoch jednotlivých fragmentov DNA. Pretože je ku každej polohe pripojených asi 1 000 kópií DNA, je možné počas krokov sekvenovania ľahko detekovať novo pridané nukleotidy.