Kyselina linolová konjugovaná s cis-9, trans-11 inhibuje zápalové procesy na modeloch astmy in vitro a in
1 Z ÚSTAVU PRE VÝŽIVOVÉ VEDY VÝŽIVOVEJ FYZIOLÓGIE FRIEDRICH-SCHILLER-UNIVERSITÄT JENY LEHRSTUHLOVEJ VÝŽIVOVEJ FYZIOLÓGIE Kyselina linolová konjugovaná s cis-9, trans-11 inhibuje zápalové procesy v modeloch astmy in vitro a in vivo. Farmaceutická fakulta Univerzity Friedricha Schillera v Jene, autorka Anke Magdalena Jaudszus z Mechterstädt Jena, 2008
2 recenzenti: 1. Prof. Dr. Gerhard Jahreis 2. Prof. Dr. Stefan Lorkowski 3. Prof. Dr. DR. Lampy Alfonso Dátum sporu: 26. februára 2009
3 Moji rodičia Annemarie a Dietmar a všetky deti v štúdii CLA
4 OBSAH Zoznam skratiek V Zoznam obrázkov VII Zoznam tabuliek IX 1 Úvod Bronchiálna astma Definícia a epidemiológia Diagnóza Patofyziológia Imunologické základy Alergická senzibilizácia Alergické reakcie Príčiny a rizikové faktory Genetika Faktory životného prostredia Infekcie a hygiena Hypotéza Diéta Hypotéza Konjugovaná C Syntéza CLA Bakteriálne chemické fyziologické účinky Peroxizómové proliferátory aktivované receptory (PPAR) Členovia rodiny PPAR Štruktúra Kontrola génovej expresie PPAR a zápal dýchacích ciest CLA vyvoláva protizápalové účinky prostredníctvom PPAR Cieľ Hypotéza Špeciálny cieľ Časť I: Imunológia In vitro model In vivo model Časť II: Metabolizmus Materiál a metódy In vitro model Bunkové biologické metódy Stimulanty a inhibítory Mastné kyseliny PPARγ antagonista GW lipopolysacharid Z elllinie BEAS-2B kultivácia dlhodobá skladovacia stimulácia izolácie BEAS-2B a čistenie eozinofilov prietoková cytometria kokultúra BEAS-2B a eozinofilov I.
7 OBSAH 9.4 Začlenenie c9, t11-cla do BEAS-2B po 24 hodinách detekcie t7, c9- a t8, c10-cla do c9, t11-cla-píku Doplnený olej: doplnený olej bohatý na triazylglycerol bohatý na c9, t11-cla.: CLA-Mix Triazylglycerol Distribúcia mastných kyselín po strave bohatej na olivový olej Vyhlásenie Poďakovanie Publikácie a príspevky na konferencii CV IV
28 ÚVOD (Chin et al. 1994). Pretože sa však väčšina výskumov uskutočňovala s izomérnymi zmesami, ktoré obsahovali c9, t11-cla a t10, c12-cla v približne rovnakých častiach a malom množstve iných izomérov, pozorované účinky nebolo možné jednoznačne priradiť jednému alebo druhému izoméru. Vylepšené metódy syntézy pre zastúpenie jednotlivých izomérov teraz umožňujú oveľa diferencovanejší pohľad na celkom odlišné a niekedy protichodné spôsoby pôsobenia c9, t11-cla a t10, c12-cla (Tab. 2 a 3). 16
48 MATERIÁL A METÓDY Detekcia: Enzýmové činidlo: Sekundárna protilátka: biotinylovaná anti-ľudská IL-8 mAb (klon G 265-8, BD Pharmingen): 1 µg/ml v blokujúcom tlmivom roztoku Avidin-HRP (BD Pharmingen) 1: 1000 v blokujúcom tlmivom roztoku Substrátové činidlo: TMB 1: 100 v tlmivom roztoku Gallati TMB: 240 mg 3,3,5,5-TMB (Fluka, Neu-Ulm, D) 5 ml DMSO (Sigma) 5 ml etanolu Gallati tlmivý roztok: Citrátový tlmivý roztok: Stop Roztok: 0,034% H202 (Merck) v citrátovom pufri 33,6 g monohydrátu kyseliny citrónovej v 400 ml destilovanej vody. rozpustí sa 4 N KOH, upraví sa na pH 3,95 destilovanou vodou. doplňte na 500 ml 1 M H 3 PO 4 (všetky Merck) ELISA na kvantifikáciu ECP ELISA na detekciu ECP sa uskutočňovala pomocou komerčne dostupnej súpravy (MBL, MoBiTec, Göttingen, D) podľa odporúčania výrobcu. 96 mikrotitračných doštičiek zahrnutých v súprave bolo už potiahnutých a roztoky boli pripravené na použitie alebo boli pripravené podľa pokynov. Detekčný limit tejto súpravy bol 0,125 ng/ml. 36
49 MATERIÁL A METÓDY In vivo model Ženské BALB/c sa získali od Harlana Winkelmanna (Borchen, D) a mali 6 až 8 týždňov, keď boli prijaté. Všetky experimenty boli schválené Štátnym úradom pre bezpečnosť, ochranu zdravia a technickú bezpečnosť v Berlíne (LAGetSi) ako rozšírenie existujúcej aplikácie experimentov na zvieratách (reg. G 0247/03) podľa nemeckého zákona o dobrých životných podmienkach zvierat. 3.4 CLA oleje doplnené o krmivo Triazylglycerol bohatý na C9, t11-CLA (tab. 6, obr. 13) sa uskutočňoval pomocou metódy premeny metyl ricinolátu () a prípravku CLA-Mix (tab. 6, obr. 13) Zásadou katalyzovaná izomerizácia kyseliny linolovej vyrobenej na báze svetlicového oleja (obidve Cognis, Illertissen, D). Tabuľka 6: Zloženie mastných kyselín v prípravkoch CLA. GC analýza. Mastná kyselina [% FSME] c9, t11-číra TAG CLA zmes TAG C14: 0 0 0 C16: 0 0,2 2,6 C18: 0 0,5 2,8 C18: 1c9 1,8 14,4 C18: 1c11 0,3 0,7 C18: 2n6 3,1 0,3 C18: 3n3 0,2 0 C20: 0 0,1 0 C20: 1 0,5 0 C20: 5n3 0,4 0 CLA 86,6 78,0 Ostatné 6.7 1.4 Skratky: TBE metylester mastných kyselín, TAG triazylglycerol 37
50 MATERIÁL A METÓDY A c9, t11-cla bohatý DEŇ B CLA mix DEŇ 1,4% 0,3% 0,4% 22,1% c9, t11-cla 0,1% 0,4% c11, t13 -cla t10, c12-cla c9, c11-cla t9, t11-cla 45,0% 52,6% 74,9% Obr. 13: Distribúcia izomérov prípravkov CLA. A: c9, t11-cla-rich TAG. B: CLA-Mix DEŇ. Je zobrazené percento z celkovej CLA. HPLC analýza (9.5) Režim kŕmenia Po 5 dňoch adaptácie na podmienky ustajnenia (22 ° C, 12-hodinový cyklus svetlo/tma, max. 5 zvierat/klietka v policovom systéme IVC) boli zvieratá náhodne rozdelené do testovacích skupín. Skúšobné diéty boli založené na udržovacej diéte V1535 od spoločnosti ssniff (Soest, D) a išlo o špeciálne objednávky, ktoré boli obohatené o príslušné oleje (tab. 7). Tabuľka 7: Zloženie mastných kyselín v testovacích diétach [g/kg]. Kontrola základného krmiva Kontrola primárnej prevencie Sekundárna prevencia c9, t11 - CLA CLA-Mix mastná kyselina Pridaný olej 1,5% slnečnicový olej d, 3% olivový olej d, 5% slnečnicový olej 1,5% c9, t11-číra DEŇ C14: 0 0,1 0, 1 0,1 0,1 0,1 0,1 C16: 0 4,7 5,6 5,0 5,6 4,7 5,1 C18: 0 0,8 1,4 1,2 1,4 1,4 0,9 1,2 C18: 1c9 6,2 10,0 16,1 10,0 6,5 7,7 C18: 2n6 18,0 27,8 18,8 27,8 18,4 18,3 c9, t11-cla, 9 5,0 c9, c11-cla, 9 0,1 t10, c12-cla, 9 C18: 3n3 2,3 2,5 2,4 2,5 2,5 2,3 C20: 0 0, 1 0,1 0,2 0,1 0,1 0,1 C20: 1 0,2 0,2 0,2 0,2 0,3 0,2 C20: 4n Ostatné 0,3 0,3 0, 3 0,3 0,7 0,3 1,3% CLA-Mix DEŇ 38
56 MATERIÁL A METÓDY Tabuľka 9: Priméry a sondy použité na amplifikáciu PPARγ. Primér génovej nukleotidovej sekvencie FW 5 -TAA CTG CCG GAT CCA CAA A-3 PPARγ primer RV 5 -ATC TCC GCC AAC AGC TTC T-3 sonda 5 fam-ctg TCG GTT TCA GAA GTG CCT TGC-3 tam primer FW 5 -GTT TGA GAC CTT CAA CAC CCC A-3 ß-aktínový primer RV 5 -GAC CAG AGG CAT ACA GGG ACA-3 sonda 5 vic-cca TGT ACG TAG CCA TCC AGG CTG TG-3 tam 10 ul templátu (100 ng) bolo 40 ul optimalizovanej reakčnej zmesi pipetovalo (tab. 8) a analyzovalo sa trikrát na optických 96-jamkových doštičkách (ABgene, Epsom, UK) v systéme PCR v reálnom čase (Applied Biosystems) s použitím nasledujúceho teplotného programu: Tabuľka 10: Teplotný program pre amplifikáciu PPARy. Teplota [C] Časové cykly min min s 60 1 min 40 Ako interný štandard bola v každom cykle zahrnutá séria riedenia celkovej RNA extrahovanej z buniek LA-4. Proteínové biochemické metódy ELISA na stanovenie IL-5 v BAL Vykonanie ELISA: Zloženie roztokov: Poťah: Primárna protilátka: Anti-myšací IL-5 mAb (klon TRFK5, BD Pharmingen): 2 µg/ml v poťahovacom tlmivom roztoku Poťahovací pufor: 8,4 g NaHC03, v 1 l destilovanej vody. . rozpustite, upravte na pH 8,2 pomocou 10 N NaOH Premývací pufor: 0,05% Tween 20 v PBS 44
62 MATERIÁL A METÓDY ANOVA). Pretože pre tento parameter bolo možné interpretovať iba hlavné účinky diét, rozdiely medzi skupinami sa stanovili pomocou nespárovaných Studentových T-testov. Krivky P zosilnenia sa hodnotili pomocou ANOVA pre opakované merania. Porovnanie skupín c9, tll-cla OVA s GW9662 a bez neho, ako aj údaje z prístupu sekundárnej prevencie a tkanivových koncentrácií mastných kyselín sa uskutočnili pomocou jednorozmernej analýzy odchýlok (ANOVA). Vplyvy stravy na zloženie mastných kyselín v skúmaných orgánoch sa hodnotili pomocou korelačnej analýzy. Prah významnosti bol stanovený s pravdepodobnosťou chyby 5% (p 0,05). 50