Laboratórny vestník - Metódy - Optimalizované médium pre bunkovú kultúru
Mirja Krause
Produkcia rozpustných rekombinantných proteínov v bakteriálnych bunkách nemusí vždy fungovať hladko. Mirja Krause vysvetľuje, ako môže novo vyvinutý systém bunkových kultúr En Base významne zvýšiť hustotu buniek a množstvo rozpustného proteínu na bunku.
Úloha bunkových kultúr, ktoré sa používajú na expresiu rekombinantných proteínov, je v zásade veľmi jednoduchá: mali by produkovať čo najaktívnejšie rozpustné proteíny. Pri mnohých štandardných protokoloch o bunkovej kultúre to však funguje iba čiastočne alebo niekedy vôbec. Najznámejším protokolom na kultiváciu buniek E. coli v trepacích bankách je pravdepodobne protokol Sambrook, ktorý je uvedený v „Biblii molekulárnej biológie“ Toma Maniatisa. Už viac ako 20 rokov používajú molekulárni biológovia tento protokol ako sprievodcu, ktorý často funguje - ale nie vždy.
Bielkoviny, ktoré sa dajú pomocou Sambrooka alebo iného štandardného protokolu exprimovať iba slabo alebo vôbec, sa zvyčajne považujú za „náročných kandidátov“, ktorí si vyžadujú špeciálne triky. Tieto prípady sa vyskytli aj v našej pracovnej skupine a často sme pomocou lupy hľadali pásy exprimovaného proteínu v géloch SDS-PAGE.
Prejedené baktérie
Dôvodom zlého výťažku v expresii proteínov v bakteriálnych kultúrach je často jav, ktorý sa vyskytuje aj u ľudí: baktérie sa jednoducho prejedajú. Médiá na pretrepávanie kultúr zvyčajne „fungujú“ ako dávkové kultúry a od prvej sekundy obsahujú všetky zložky a živiny pre ďalšiu kultiváciu. Proces je väčšinou nekontrolovaný, to znamená, že nie sú kontrolované dôležité parametre, ako je hodnota pH, množstvo rozpusteného kyslíka a koncentrácia glukózy v médiu.
Výsledkom je, že vysoká rýchlosť dýchania rýchlo rastúcich baktérií presahuje rýchlosť prenosu kyslíka do kultúry. To rýchlo vedie k vyčerpaniu kyslíka a tým k obmedzeniu rastu. Baktérie teraz pomaly rastú a znižujú produkciu bielkovín. Prispôsobujú svoj metabolizmus podmienkam anaeróbnej kultúry a uvoľňujú metabolity, ktoré znižujú hodnotu pH. Okrem toho nekontrolované množstvo glukózy prítomné v štandardnom komplexnom médiu vedie k prebytku metabolizmu. To spôsobí, že sa hromadí ďalší octan, ktorý ďalej znižuje hodnotu pH kultivačného média, až kým nadmerne zjedené baktérie konečne „neochorejú“.
Celé sa to posilní, keď sú pretrepávacie banky - ako je to bežné v mnohých laboratóriách - uzavreté bavlnenými zátkami, hliníkovou fóliou alebo kovovými uzávermi. Prenos kyslíka do kultúr klesá na nulu a urýchľuje sa prechod na anaeróbne, to znamená nepriaznivé kultivačné podmienky. Riešenie na prepravu kyslíka do baniek ponúkajú samolepiace, sterilné, jednorazové tesniace membrány, takzvané AirOtop Seals. Membrány AirOtop neprepúšťajú do kultúry zvonku žiadne choroboplodné zárodky, ale kyslík. Vyššie opísaný problém s prejedaním sa stále zostáva.
Aby sa bunky udržali zdravé, definované množstvo glukózy sa kontinuálne čerpá do fermentačných reaktorov v takzvanom procese plnenia dávkou. Senzory zároveň riadia hodnotu pH a obsah kyslíka. Týmto spôsobom je možné dosiahnuť veľmi vysoké hustoty buniek a zvýšiť produkciu rozpustných rekombinantných proteínov.
Ako sa však dá princíp fed-batch presunúť z bioreaktorov do trepacích baniek alebo mikrotitračných doštičiek? Jednoducho: nasadením baktérií na „cukrovú diétu“.
Médium z Fínska
Pred niekoľkými rokmi vyvinula skupina Petera Neubauera na univerzite v Oulu vo Fínsku systém bunkovej kultúry EnBase (dodávka substrátu na báze enzýmu), ktorý riadeným spôsobom uvoľňuje glukózu do média prostredníctvom enzymatického štiepenia škrobu (Panula-Perälä et al., Microbial Cell Továrne 2008, 7:31). Medzitým sa inžinier bioprocesu Neubauer presunul z ďalekého severu na TU Berlin a so svojím tímom vytvoril ďalšie médium s názvom EnBase Flo, ktoré obsahuje polyméry uvoľňujúce glukózu v rozpustnej forme.
Cukorová diéta
Pomocou EnBase Flo možno množstvo glukózy v médiu regulovať pomocou koncentrácie enzýmu (glukoamylázy), ktorá je nastavená v kultúre (Krause et al., Microbial Cell Factories 2010, 9:11). Cukorová diéta zabraňuje škodlivému prebytočnému metabolizmu v baktériách a zaisťuje, že hodnota pH zostane stabilná viac ako dva dni, a teda podstatne dlhšie ako v prípade média LB, v ktorom je hodnota pH konštantná iba šesť až osem hodín. Takzvané posilňovacie tablety dodatočne posilňujú účinok stabilizujúci pH. Baktérie tak zostávajú zdravé a je možné ich kultivovať za kontrolovaných a stabilných podmienok, pri ktorých dosahujú výrazne vyššie hustoty buniek. Okrem toho sa výťažok rozpustného aktívneho proteínu zvyšuje až desaťkrát. Medzitým je EnBase Flo Medium, ktoré je vhodné nielen pre laboratórne použitie, ale aj pre procesy s vysokou výkonnosťou, dostupné vo formáte tabletu pod názvom EnPresso, čo ešte viac uľahčuje kultiváciu.
Nasledujúci krátky protokol ilustruje, ako jednoduchá je bunková kultúra so systémom EnBaseFlo. Potrebujete: 500 ml sterilnú banku, sterilnú vodu, antibiotiká, induktor a súpravu tabliet enpresso. Prvým krokom je príprava predkultúry. Toto je možné naočkovať z kvapalnej kultúry na noc, glycerolovej tyčinky alebo z agarovej platne. Potom za sterilných podmienok pridajte do 500 ml banky 50 ml sterilnej vody a dve stredné tablety, počkajte, kým sa tablety nerozpustia, a potom pridajte požadované antibiotikum a 50 ul EnZ’Im (glukoamyláza). Predkultúra sa potom naočkuje (OD600 = 0,05 až 0,15), banka sa uzavrie membránou AirOtop a začne sa kultivácia. Po kultivácii cez noc (16-20 hodín) sa pridá posilňovacia tableta, 50 ul EnZ'Im a induktor. V kultivácii sa potom pokračuje a bunky sa zbierajú po 24 hodinách.
Posledné zmeny: 23. 2. 2011