Ľudský 3D model extracelulárnej maticovej adipocytovej kultúry na štúdium metabolizmu maticových buniek

Zhrnutie

Popisujeme 3D kultivačný systém in vitro matrix človek-človek extracelulárna matrix-adipocyt, ktorý umožňuje štiepenie rolí matrix a adipocytov pri kódovaní metabolického fenotypu tukového tkaniva.

Abstrakt

Úvod

Extracelulárna matrica (ECM) poskytuje nielen mechanický rámec pre tkanivo, ale tiež zasahuje do komplexného vzájomného rozhovoru s bunkami, ktoré sa v ňom nachádzajú, a reguluje rôzne procesy potrebné pre homeostázu tkaniva, vrátane bunkovej proliferácie, diferenciácie, Signalizácia a metabolizmus 1. Zatiaľ čo zdravá ECM hrá zásadnú úlohu pri udržiavaní normálnej funkcie tkaniva, dysfunkčná ECM sa podieľa na niekoľkých ochoreniach 2 .

Tukové tkanivo hrá dôležitú úlohu v patogenéze metabolických chorôb. Obezita je spojená s nadmernou hypertrofiou adipocytov a bunkovou hypoxiou, poruchami metabolizmu adipocytových buniek a tukového tkaniva, väčším počtom endoplazmatického retikula a oxidačným stresom a zápalmi. Aj keď to nie je úplne pochopené, tieto zložité procesy sa spoliehajú na kompromisné tlmenie kapacity tukového tkaniva, čo vedie k pretečeniu živín z tukového tkaniva, toxicite viacerých tkanív a systémovému metabolickému ochoreniu 3, 4, 5. Poradie udalostí a špecifické mechanizmy, ktoré sú základom zlyhania tukového tkaniva, nie sú dobre pochopené, ale boli zapojené zmeny v ECM v tukovom tkanive. Zloženie ECM sa mení v tukovom tkanive u ľudskej a myšej obezity so zvýšeným ukladaním proteínu ECM spolu s kvalitatívnymi biochemickými a štrukturálnymi rozdielmi v ECM tukového tkaniva spojenými s ľudskými metabolickými chorobami vrátane cukrovky typu 2 a hyperlipidémie 6, 7, 8, 9, 10, 11 .

Napriek týmto pozorovaniam nie je úloha ECM v tukovom tkanive pri sprostredkovaní dysfunkcie tukového tkaniva dobre definovaná. To je čiastočne spôsobené nedostatkom robustných experimentálnych modelov, ktoré umožňujú rozdelenie špecifických úloh ECM a adipocytov pri regulácii konečnej tukovej funkcie. Kultúra ECM adipocytov simuluje in vivo prostredie natívneho tukového tkaniva najmenej v dvoch bodoch. Po prvé, ECM kultúra poskytuje molekulárne prostredie, ktoré je podobné natívnemu tukovému tkanivu, vrátane natívnych kolagénov, elastínov a iných proteínov matice, ktoré v štandardnej 2D kultúre chýbajú. Po druhé, ukázalo sa, že kultúra na 2D plaste mení metabolizmus adipocytov mechanickými účinkami v dôsledku zníženej elasticity plastového substrátu 12, čo eliminuje ECM kultúru.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

Obézne tkanivá sa získavajú od ľudských subjektov podrobujúcich sa voliteľnej bariatrickej chirurgii na základe schválenia inštitucionálnou kontrolnou komisiou.

1. Izolácia Preadipocytov a príprava kultivačného činidla

  1. Pripravte 2% hovädzí sérový albumín (BSA) v 1 x fosfátom pufrovanom soľnom roztoku (PBS). Filter vysterilizujte a uložte pri 4 ° C.
  2. Pripravte si kolagénový nos typu II: 2 mg/ml v 2% BSA v 1x PBS. Pripravte bezprostredne pred použitím.
  3. Pripravte si lyzačný roztok červených krviniek (RBC): 1,5 M NH4CI, 100 mM NaHC03, 10 mM disodná soľ EDTA v deionizovanej vode (DI/H20). Skladujte pri 4 ° C. Pripravte si 1x RBC lyzačný roztok z 10x skladovacieho roztoku v DI/H2O bezprostredne pred použitím.
  4. Pripravte si rastové médium: 15% fetálne bovinné sérum (FBS), 1% antifungálny roztok (ABAM) v modifikovanom orlom médiu Dulbecco: výživná zmes F-12 (DMEM/F12). Filter vysterilizujte a uložte pri 4 ° C.
  5. Pripravte si zmrazovací roztok preeadipocytov: 10% dimetylsulfoxid, 15% FBS v médiu DMEM/F12. Filter vysterilizujte a uložte pri 4 ° C.
  6. Príprava diferenciačného média: 10 mg/l transferínu, 33 'M biotínu, 0,5' M roztoku ľudského inzulínu, 17 'M hemivápenatej soli kyseliny D-pantoténovej, 100 nM dexametazónu, 2 nM 3,3', sodnej soli 5-trijód-L-tyronínu. (T3), 1 izobutyl-1-metylxantín (IBMX), 1% ABAM v DMEM/F12. Filter vysterilizujte a uložte pri 4 ° C.

3. Príprava reagencie na metabolické fenotypizovanie

  1. Príjem glukózy
    1. Pripravte si médium na hladovanie séra: DMEM/F12, 1% ABAM. Filter vysterilizujte a uložte pri 4 ° C
    2. Tesne pred použitím pripravte 200 nM roztok ľudského inzulínu v 1x PBS.
    3. Pripravte 200 nM ľudský inzulín, 0,1 mM 2-deoxy-D-glukózy, 1 Ci/jamku deoxy-D-glukózy, 2- [1,2-3 H (N)] -, v 1 x PBS. Pripravte bezprostredne pred použitím.
  2. Lipolýza
    1. Pripravte izoproterenol zriedený v PBS: 3 mM zásobný roztok. Pre skúšku zrieďte pracovnú koncentráciu 3 m.
  3. Olejové červené-O sfarbenie
    1. Pripravte 4% formalín v DI/H2O. Pri izbovej teplote.
    2. Pripravte si pracovný roztok Oil Red-O. Roztok oleja Red-O (ORO) sa zriedi s DI/H2O v pomere 3: 2 (ORO: DI/H2O). Pripravte bezprostredne pred použitím. Prefiltrujte cez filtračný papier (Materiálová tabuľka).

4. Odber tukového tkaniva

POZNÁMKA: Viscerálne tukové tkanivo (DPH) chirurg odstráni z väčšieho omenta na začiatku operácie a transportuje ho späť do laboratória na ľade na okamžité spracovanie. Pri manipulácii so všetkými ľudskými tkanivami a žieravými činidlami by sa mali dodržiavať univerzálne preventívne opatrenia, vrátane vykonávania všetkých prác v laminárnom prietokovom kryte, s úplným laboratórnym bezpečnostným opotrebením a bez relapsu ihiel.

  1. Pridajte 5 - 10 g neporušenej DPH do 15 - 25 ml zmrazovacieho tlmivého roztoku v 50 ml kónickej skúmavke na ponorenie vzorky tkaniva. Skladujte vzorky pri -80 ° C až do decellularizácie až 1 mesiac.
  2. Na izoláciu prereadipocytov použite samostatnú vzorku čerstvej nádoby, ako je opísané v časti 5.

6. Príprava ECM z tukového tkaniva

8. Metabolický fenotyp

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Reprezentatívne výsledky

model
Obrázok 1: Pracovný postup pre prípravu adipocytov ECM. Deň 1: Vzorky celého viscerálneho tukového tkaniva prechádzajú tromi cyklami zmrazenia a roztopenia, po ktorých nasleduje nočná inkubácia s enzymatickým tráviacim roztokom # 1. Deň 2: Po štiepení enzýmovým roztokom č. 1 sa vzorky štiepia enzymatickým roztokom č. 2 cez noc. V tomto okamihu sú vzorky čiastočne delipidované. Deň 3: Po enzymatickom štiepení č. 2 sa vzorky inkubujú cez noc s polárnym rozpúšťadlovým extrakčným roztokom, ktorý dokončí delipidáciu. Po 3. dni by mali byť vzorky úplne delipidované a biele/priesvitné. Vzorky sa dôkladne premyjú preplachovacím tlmivým roztokom, potom 70% etanolom a skladujú sa v skladovacom roztoku pri 40 ° C, kým sa nedajú doplniť presipocytmi. Deň 4: Preadipocyty sa naočkujú na 14 dní decellularizovanú DPH, po ktorej nasleduje adipogénna diferenciácia. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

adipocytovej
Obrázok 2: Pracovný postup izolácie predeadipocytov. Daň z obratu je rozsekaná, natrávená kolagenázou, prefiltrovaná, odstredená a výsledná peleta stromovaskulárnych buniek je pozlátená a kultivovaná za účelom expandovania presipocytov. Viac informácií o izolácii ľudských presipocytov a kultivácii 2D adipocytov nájdete v Baker et al. 2017 21. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

model
Obrázok 3: Skenovanie snímok elektrónovou mikroskopiou. Intaktné tukové tkanivo, decellularizované tukové tkanivo a decellularizované tukové tkanivo, ktoré bolo znovu osídlené prepocytmi po dobu 14 dní a diferencované v adipogénnom prostredí. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Diskusia

Boli publikované podobné metódy na izoláciu ECM z tukového tkaniva a naočkovanie presipocytmi s dôkazmi, ktoré naznačujú, že ECM môže podporovať adipogénnu diferenciáciu bez klasických adipogénnych mediátorov, vrátane agonistov cAMP. Inzulín a agonisty PPAR 12, 14. Naše údaje sú prvými, ktoré demonštrujú špecifickú reguláciu bunkového metabolizmu ECM v tukovom tkanive pomocou metód, pri ktorých sú adipocyty stimulované klasickými adipogénnymi diferenciačnými faktormi 11; podobné štúdie bez adipogénnych stimulov sú cieľom budúceho výskumu. Iné majú podobný prepad ECM buniek špecifických pre dané ochorenie s ECM a bunkami z pľúcneho tkaniva 19, 20. Boli tiež použité alternatívne stratégie, vrátane vytvárania matríc zmiešaním homogenizovaných prípravkov ECM z tukového tkaniva v peptidových hydrogéloch 12 .

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Zverejnenie

Autori nedeklarujú žiadne protichodné záujmy.