Matricové metaloproteinázy a ich inhibítory v priebehu experimentálnej chronickej

1 Matricové metaloproteinázy a ich inhibítory v priebehu experimentálnej chronickej pankreatitídy.

matricové

2 Matricové metaloproteinázy a ich inhibítory v priebehu experimentálnej chronickej pankreatitídy. urna: nbn: de: gbv: 28-diss

4 1 Úvod a kladenie otázok Úvod Extrakcia materiálu Choroby pankreasu Akútna pankreatitída Chronická pankreatitída Zvieracie modely pankreatitídy Modely akútnej pankreatitídy Ceruleínová pankreatitída Diéta s nízkym obsahom cholínu Trypsínový model Operatívna obštrukcia dvanástnika Modely chronickej pankreatitídy Operatívna obštrukcia dvanástnika kyselina olejová kyselina linealná z transformačného rastového faktora - v pankrease v transgénnej myši nadexpresia transformačného rastového faktora - v pankrease v transgénnej myši Transgénna myš s dominantne negatívnym mutantom receptora TGF typu II Pankreas vznikol indukciou kyselinou trinitrobenzénsulfónovou (TNBS) Chronická experimentálna pankreatitída vyvolaná Dibutylcíndichlorid Pankreatické stelátové bunky Matrix metaloproteinázy a tkanivové inhibítory matricových metaloproteináz Fibróza, pankreatické stelátové bunky a matricové metaloproteinázy 16 2 Materiál a metódy Materiál Chemikálie DNA Oligonukleotidy Pufre a roztoky Bakteriálne kultivačné médiá Súpravy Laboratórne zvieratá Spotrebný materiál Prístroje Indukcia chronickej DBTC Pankreatitída 21 1

5 2.3 Extrakcia RNA z pankreasu Detekcia fragmentu riadiaceho expresiu mrna Plazmidová DNA amplifikácia baktérií Kvantifikácia nukleových kyselín RNA elektroforéza Reverzná transkriptáza Konkurenčná polymeráza Reťazová reakcia Elektroforéza produktov PCR a fluorescenčná analýza Príprava pankreatických hviezdicových buniek PCR pankreatických hviezdicových buniek Zymografia Odber vzoriek a stohovací gél Vykonanie elektroforézy a vyhodnotenie farbenia hematoxylínom a eozínom 32 3 Výsledky Histológia DBTC pankreatitídy Úprava cdna pomocou -aktínovej expresie matrixových metaloproteináz v tkanivovej expresii MMP expresie MMP-2 a MMP expresie tkanivového inhibítora matrixových metaloproteináz v tkanive Expresia TIMP Expresia TIMP MMP v pankreatických hviezdicových bunkách Štatistika 41 4 Diskusia Priebeh DBTC pankreatitídy MMP MMP-9 z leukocytov Vzťah medzi bazálnou membránou a MMP syntézou MMP-9 v expresiách PSC RNA na MMP-9 pri chronickej DBTC pankreatitíde RNA expresia MMP-2, MMP-3, TIMP-1 a TIMP-2 pri chronickej DBTC pankreatitíde Závery 47 2

6 5 Diplomové práce 48 6 Zoznam skratiek 51 7 Literatúra 52 8 Poďakovanie 66 9 Vyhlásenie o nezávislosti 67 3

16 Obrázok 1: Bunkové funkcie pod vplyvom proteolyticky aktívnych MMP. (A) Degradácia ECM a migrácia buniek. (B) indukcia proliferácie alebo apoptózy. (C) Modulácia mediátorov a ich receptorov. (D) Aktivácia ďalších proteáz štiepením ich proenzýmov alebo inhibítorov (Vu a Werb, 2000). 3 Matričné ​​metaloproteinázy sú skupinou viac ako 20 známych proteáz závislých od zinku. Sú schopné rozkladať základné zložky extracelulárnej matrix, ako je kolagén, laminín, fibronektín alebo elastín. Vďaka svojej štruktúre z rôznych domén možno MMP rozdeliť do štyroch skupín: matrylizín, MMP s doménami podobnými hemopexínu, MMP s transmembránovými doménami, MMP s doménami podobnými fibronektínu. Všetky MMP majú oblasť potrebnú na vylučovanie, sú v latentnom stave a majú katalytickú oblasť, ktorá obsahuje aktívne väzbové miesto pre zinok. 53 Klasifikácia MMP sa však uskutočňuje ich rozdelením do skupín, ktoré sumarizujú substráty MMP (Tab. 1)

18 To platí aj pre proenzýmy. Prekrývanie sa špecifikácie je vysvetlené 50% sekvenčnou homológiou TIMP-1 a TIMP-2. 58,61 Výsledná aktivita MMP závisí od pomeru MMP a TIMP v tkanive. Zmeny v tejto rovnováhe vedú buď k významne zvýšenej proteolytickej aktivite MMPs 59, alebo k zvýšeniu fibrogenézy. 60 Názov TIMP-1 TIMP-2 TIMP-3 Funkcia TIMP-4 Inhibuje Pro-MMP-9 a ďalšie aktívne MMP Inhibuje Pro-MMP-2 a aktívne MMP-2 Nie sú definované. Nie sú definované. Tabuľka 2: Inhibítory tkanív matricových metaloproteináz ( TIMP) a ich funkcie Obrázok 2: Kaskáda aktivácie matrixových metaloproteináz katepsínom a plazmínom. Automatická aktivácia Pro MMP aktívnymi MMP a MT MMP 1. Inhibícia degradácie matrice TIMP. (Evans a kol. 1999) 61 15

22 TIMP 2 dĺžka amplikónu: 453 bp TIMP 2 antisense CAA CAG GCG TTT TGC AAT GCA GA dĺžka: 23 bp CCC ATT GAT GCT CTT CTC TGT GA dĺžka 23 bp vektory pqr2 a pqr3 od Graham M.A. Wells, Neures Limited, UK Pufre a roztoky Roztok Comassie Blue Roztok DBTC DEPC-H 2 O 1 diel ľadovej kyseliny octovej (50 ml) 3 diely izopropanolu (150 ml) 6 dielov H2O (300 ml) Pridajte 0,25 g Comassie Blue k 100 ml (1,25 g) . DBTC sa rozpustí v 96% etanole na dve časti. Potom zmiešajte s tromi dielmi glycerolu. Inkubujte 1 L dh20 s 1% DEPC cez noc. Potom deaktivujte DEPC autoklávovaním. Eozín 2,5 g Eozín (číslo farebného indexu) 500 ml H20 HBSS + FCS Mayers Hematoxylín PBS (fosfátový tlmivý roztok) polyakrylamidový elektroforézny tlmivý roztok 50 ml HBSS a 15 ml FCS 4%, vložte na ľad. V 750 ml vody sa rozpustí: 50 g síranu hlinitého (KAl (SO4) 2 12H20) 1 g hematoxylínu (číslo farebného indexu) 0,1 g jodidu sodného (NaI03) 1,0 g kyseliny citrónovej 50 g chlorohydrátu Ad H20 do 1 000 ml 120 mM NaCl 170 mm NaH2P04 3 mm KCl 26 mm KH 2P04, ph 7,2 3,03 g (0,025 M) Tris 14,1 g (0,152 M) glycín 1,0 g (0,1%) SDS do 1 000 ml naplneného vodou. Tlmivý roztok P1, Qiagen 50 mM Tris ph mM EDTA Rnáza A (400 μg/ml) Tlmivý roztok P2, Qiagen 200 mM NaOH 1% SDS Tlmivý roztok P3, Qiagen 2,55 M KAc ph 4,8 Tlmivý roztok QBT, Qiagen 750 mM NaCl 50 mM MOPS 15% etanol ph

23 tlmivý roztok QC, tlmivý roztok Qiagen QF, zastavovací roztok Qiagen substrátový tlmivý roztok tlmivý roztok TAE 1L 1M NaCl 50mM MOPS 15% etanol Ph M NaCl 50mM MOPS 15% etanol ph mg oranžová G 2,5g Ficoll 400 EDTA 0,5M 50mmol/l Tris ph8 + 5 mmol/l CaCl2 242 g Tris 57 ml kyseliny octovej 96% 100 ml EDTA 0,5 M ph8 až 1 000 ml H20 dvojitá dest. Tris pufor Tris-HCl 1 M v DEPC-H20, pH 7,4 Tritonový roztok 2,5% 10 ml Triton + 490 ml H20. Ako bakteriálny kmeň sa použilo bakteriálne kultivačné médium Kmeň Escherichia coli DH5, od firmy Gibco BRL (Eggenstein, Nemecko). Kultivačné médium pre bakteriálny rast sa získalo od Difco Laboratories, Detroit, USA. Platne s agarom s ampicilínom LB Pridajte 100 mg/l ampicilínu na platne s agarom LB. LB agarové platne Luria Bertani (LB) - stredné 5 g kvasnicového extraktu 10 g tryptického peptónu 10 g NaCl aqua dest. 15 g agaru H2O redist na 1 l 5 g kvasnicového extraktu 10 g tryptického peptónu 10 g NaCl aqua dest. Upravte na pH 7,4 H20 redistovanou pomocou 1 N NaOH. na 1 l transformačného tlmivého roztoku 10% (hmotn./obj.) polyetylénglykol mM MgCl2 v súpravách LB-Medium Qiagen Miniprep Qiagen Maxiprep QIAquick Spin RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Nemecko Qiagen, Hilden, Nemecko Qiagen, Hilden, Nemecko Qiagen, Hilden, Nemecko 20