Metódy na štúdium väzby ligandov

Metódy vyšetrenia väzieb ligandov Rovnovážna dialýza Kinetika enzýmov modulu: Vedúci: Prof. Hans Bisswanger Dohľad: Elena Kracker Testovací protokol: Paula Quecke Stefan Mogk Strana 1 z 15

štúdium

Titulný obrázok: Dialyzačný blok Obrázok je schematický a nevzťahuje sa na produkty, ktoré sú skutočne na trhu. Zobrazený blok je rozdelený na dve bunky, každá rozdelená membránou do vnútornej a vonkajšej komory. 1 Register 1.1 Obsah 1 Register. 2 1.1 Obsah. 2 1.2 Zoznam obrázkov. 2 2 Úvod. 3 3 Materiál a metódy. 3 3.1 Chemikálie a prístroje. 3 3.2 Indolový test. 4 3.3 Rovnovážna dialýza. 5 4 Experimentálna časť. 7 4.1 Kalibrácia indolového testu. 7 4.2 Stanovenie času dialýzy. 8 4.3 Uskutočnenie rovnovážnej dialýzy. 10 5 Zhrnutie a diskusia. 14 6 Literatúra. 15 1.2 Zoznam obrázkov Obrázok 1: Farbenie indolu pomocou Ehrlichovho činidla. 4 Obrázok 2: Ako funguje rovnovážna dialýza. 5 Obrázok 3: Možné metódy hodnotenia. 6 Obrázok 4: Kalibrácia indolového testu. 8 Obrázok 5: Stanovenie času dialýzy. 9 Obrázok 6: Distribúcia indolu (zánik) po dialýze. 12 Obrázok 7: Distribúcia (koncentrácia) indolu po dialýze. 12 Obrázok 8: Hodnotenie pomocou priamej aplikácie. 13 Obrázok 9: Hodnotenie pomocou dvojitého vzájomného znázornenia. 13 Obrázok 10: Scatchardovo hodnotenie. 14 Strana 2 z 15

Prevodovka T = I/I 0 [] (1) Absorpcia A = 1-T [] (2) Extinkcia E = ε * c * d [] (3) E = log 1/T (4) ε: koeficient extinkcie c: Koncentrácia d: Hrúbka vrstvy 3.3 Rovnovážna dialýza Dialyzačná bunka je rozdelená na vonkajšiu a vnútornú komoru pomocou semipermeabilnej membrány so stanovenou veľkosťou pórov: Obrázok 2: Ako funguje rovnovážna dialýza môžu byť rádioaktívne značené podľa ligandu) v rôznych koncentráciách. Membrána je priepustná iba pre ligand s nízkou molekulovou hmotnosťou (limit vylúčenia kľúčových slov), koncentračný gradient je vyvážený difúziou. Ligand viazaný makromolekulou sa odoberie z rovnováhy a nahradí sa ligandmi prúdiacimi dovnútra, kým voľné časti ligandu v obidvoch komorách nie sú rovnaké. V rovnováhe platí: [ligand, vonku] = [ligand, vnútri, voľný] (5) [ligand, vnútri, celkom] = [vnútri, voľný] + [vnútri, viazaný] (6) 5 zo 6 [Inside, bound] = [inside, total] [ligand, outside] (7), strana 5 z 15

4 Experimentálna časť 4.1 Kalibrácia indolového testu Aby bolo možné vypočítať koncentráciu indolu z nameranej absorbancie, boli urobené série riedení so známymi množstvami indolu a bol vykonaný indolový test opísaným spôsobom. Pre sériu riedení boli zámerne vybrané koncentrácie v rozmedzí okolo disociačnej konštanty. Tabuľka 1: Kalibrácia indolového testu Indol 1: 100 KPP (1 000 um) (0,1 M) V [ul] V [ul] c [um] E [] *) (572 nm) 0 250 0 0,000 5 245 20 0,041 10 240 40 0,082 15 235 60 0,110 20 230 80 0,159 (Kd = 100 µm) 25 225 100 0,207 50 200 200 0,363 Koncentrácia v rozmedzí 75 175 300 0,507 1/10 Kd