Morfologické zmeny v kardiomyocytoch, kapilárach a inervácii
édition scientifique VVB LAUFERSWEILER VERLAG VVB LAUFERSWEILER VERLAG STAUFENBERGRING 15 D-35396 GIESSEN Tel: 0641-5599888 Fax: -5599890 [email protected] www.doktorverlag.de 7 ISBN 8-9 3 8 5 CARINA GRUBER MORPH. ZMENY V SRDCI HYPER- A ATROFIA Morfologické zmeny v kardiomyocytoch, kapilárach a inervácia v prípade nutričnej hyper- a atrofie srdca myši CARINA GRUBER INAUGURÁLNA DIZAZÁCIA na získanie titulu Dr. med. veterinár. na Katedre veterinárneho lekárstva Univerzity Justusa Liebiga v Giessene 9 5 9 0 0 2 édition scientifique VVB VVB LAUFERSWEILER VERLAG
Dielo je chránené autorskými právami vo všetkých jeho častiach. Akékoľvek použitie nie je povolené bez písomného súhlasu autora alebo vydavateľa. To platí najmä pre reprodukcie, preklady, mikrofilmovanie a ukladanie a spracovanie v elektronických systémoch. 1. vydanie 2012 Všetky práva vyhradené. Žiadna časť tejto publikácie sa nesmie reprodukovať, ukladať v systéme vyhľadávania alebo prenášať v akejkoľvek podobe alebo akýmikoľvek prostriedkami, elektronicky, mechanicky, fotokopírovaním, nahrávaním alebo inak, bez predchádzajúceho písomného súhlasu autora alebo vydavateľov. 1. vydanie 2012 2012, VVB LAUFERSWEILER VERLAG, Giessen Vytlačené v Nemecku édition scientifique VVB LAUFERSWEILER VERLAG STAUFENBERGRING 15, D-35396 GIESSEN Tel: 0641-5599888 Fax: 0641-5599890 email: [email protected]
Z Ústavu veterinárnej anatómie, histológie a embryológie na Univerzite Justusa Liebiga v Gießene Školiteľ: Prof. Dr. Martin Bergmann a Ústav pre anatómiu a bunkovú biológiu na Justus Liebig University Gießen Anatomy 1 Vedúci: PD. DR. Christian Mühlfeld Morfologické zmeny v kardiomyocytoch, kapilárach a inervácia v prípade hyper- a atrofie srdca srdca súvisiacej so stravou INAUGURAL DISSERTATION to obtain the degree of Dr. med. veterinár. na Katedre veterinárneho lekárstva Univerzity Justusa Liebiga v Giessene predložila veterinárna lekárka Carina Gruber z Heilbronn Giessen 2011
So súhlasom Katedry veterinárneho lekárstva Univerzity Justusa Liebiga Gießen dekan prof. Dr. DR. H. c. M. Kramer recenzent prof. Dr. M. Bergmann prof. Dr. C. Mühlfeld Sporný deň 30. januára 2012
Obsah Strana Zoznam tabuliek Zoznam obrázkov I III 1. Úvod 1 1.1 Anatómia srdca u cicavcov 1 1.1.1 Jemná a ultraštruktúra srdca 1 1.1.2 Jemná a ultraštruktúra nervového systému srdca 4 1.2. Prehľad literatúry 8 1.2.1 Morfologické zmeny v srdci s hyper- a atrofiou 8 1.2.1.1 Zloženie myokardu a myocyty 8 1.2.1.2 Kapiláry 10 1.2.1.3 Inervácia 11 1.2.2 Funkčné poruchy srdca v dôsledku hyper- a atrofie 12 1.2.2.1 Srdcové funkcie 12 1.2.2.2 Funkcia autonómneho nervového systému 13 1.3 Otázky a ciele práce 14 2. Materiál a metódy 16 2.1 Zvieracie modely a predúprava tkanív 16 2.1.1 Zvieracie modely 16 2.1.2 Príprava sŕdc na zaliatie do tkaniva a mikroskopiu 19 2.2 Vloženie tkaniva 21 2.2.1 . Vloženie do Epon 21 2.2.2 Vloženie do parafínu 22 2.2.3 Vloženie do zmrazenia 24
2.3 Metódy hodnotenia jednotlivých parametrov 24 2.3.1 Imunohistochémia 24 2.3.1.1 Imunoperoxidázová metóda 24 2.3.1.2 Imunofluorescencia 26 2.3.2 Prehľad špecifických parametrov 27 2.3.3 Výpočet jednotlivých parametrov 30 2.3.3.1 Rozmery tela a srdca 2.3.3.3 Zloženie myokardu 30 .1 Experimentálna skupina na zvieratách Obezita 48 3.2.1.1 Rozmery tela a srdca 48 3.2.1.2 Zloženie myokardu 48 3.2.1.3 Kardiomyocyty 49 3.2.1.4 Kapiláry 49 3.2.1.5 Inervácia 49 3.2.2 Podvýživa experimentálnej skupiny na zvieratách 54 3.2.2.1 Rozmery tela a srdca 54 3.2.2.2 Zloženie myokardu 54 3.2.2.3 Kardiomyocyty 54 3.2.2.4 Kapiláry 55 3.2.2.5 Inervácia 55
4. Diskusia 59 4.1 Kritika metódy 59 4.1.1. Pokus na zvieratách 59 4.1.2 Odber vzoriek 61 4.1.3 Fixácia, uloženie a spracovanie vzoriek 62 4.1.4 Stereologická metóda 68 4.1.4.1 Orientácia tkaniva 70 4.1.4.2 Testovacie systémy 70 4.1.4.3 Veľkosť vzorky 71 4.1. 4.4 Ďalšie stereologické aspekty 71 4.2 Diskusia k výsledkom v porovnaní s údajmi z literatúry 73 4.2.1 Obezita 73 4.2.1.1 Vývoj srdcovej hypertrofie 73 4.2.1.2 Pomer ľavej komory k telesnej hmotnosti 76 4.2.1.3 Myokard a kardiomyocyty 77 4.2.1.4 Kapiláry 82 4.2.1.5 Inervácia 84 4.2.2 Podvýživa 87 4.2.2.1 Vývoj srdcovej atrofie 87 4.2.2.2 Pomer ľavej komory k telesnej hmotnosti 87 4.2.2.3 Myokard a kardiomyocyty 89 4.2.2.4 Kapiláry 92 4.2.2.5 Inervácia 93 4.3 Výhľad 94 5. Zhrnutie 95 6. Bibliografia 97
7. Prehľad materiálu 117 7.1 Použité látky 117 7.1.1 Chemikálie 117 7.1.2 Séra 118 7.1.3 Primárne protilátky 119 7.1.4 Sekundárne protilátky 119 7.1.5 Iné látky 119 7.2 Pufre a roztoky 120 8. Príloha 123
Tabuľka 3.4 Prehľad jednotlivých výsledkov parametrov 52, pokiaľ ide o kapiláry obéznych zvierat a združených kontrolných zvierat Tabuľka 3.5 Prehľad jednotlivých výsledkov parametrov 52, pokiaľ ide o inerváciu obéznych zvierat a združených kontrolných zvierat Tabuľka 3.6 Prehľad jednotlivých výsledkov parametrov, pokiaľ ide o 56 Rozmery tela a srdca podvyživených zvierat a pridružených kontrolných zvierat Tabuľka 3.7 Prehľad jednotlivých výsledkov parametrov týkajúcich sa zloženia myokardu podvýživených zvierat a pridružených kontrolných zvierat Tabuľka 3.8 Prehľad jednotlivých výsledkov parametrov týkajúcich sa 56 kardiomyocytov podvýživených zvierat a pridružených zvierat Kontrolné zvieratá Tabuľka 3.9 Prehľad jednotlivých výsledkov parametrov týkajúcich sa 57 kapilár podvyživených zvierat a pridružených kontrolných zvierat Tabuľka 3.10 Prehľad jednotlivých výsledkov P parametre týkajúce sa inervácie podvyživených zvierat a súvisiacich kontrolných zvierat II
Zmeny inervácie s tým spojené boli doteraz veľmi nedostatočne študované. V už spomínanej štúdii na potkanoch s hypertrofickou pravou komorou spôsobenou vysokým krvným tlakom bola zistená morfologická hyperinervácia myocytov sympatickými nervovými vláknami (Kimura et al. 2006) a pri morfologickom vyšetrení nervového systému u myší s atrofickým srdcom v dôsledku kachexie nádoru skrátenie celkovej dĺžky srdcové nervové vlákna (Mühlfeld et al. 2011). Cieľom tejto štúdie bolo štrukturálne charakterizovať rôzne kompartmenty ľavej komory v súvislosti s hyper- a atrofiou súvisiacou so stravou. Inervácia, pokiaľ ide o hyper- a atrofiu srdca súvisiacu s výživou, sa prvýkrát zaznamenala kvantitatívne a po prvýkrát sa vzťahovali aj tri kompartmenty, kardiomyocyty, kapiláry a inervácia. Údaje sa zbierali svetelnou a elektrónovou mikroskopiou pomocou stereológie. Boli podrobne stanovené nasledujúce parametre: - objem myocytov a ich organel - celková dĺžka kapilár - celková dĺžka axónov 15
trpel diabetes mellitus. Z tohto dôvodu boli všetky zvieratá (vrátane kontrolných zvierat) zbavené potravy po dobu šiestich hodín, potom boli zvážené a po ďalších šiestich hodinách hladovania bola pomocou žilovej krvi (Accu Check) stanovená hladina glukózy v krvi. Zvieratám sa potom intraperitoneálne injikovalo 10 ul/g telesnej hmotnosti 10% roztoku glukózy a hladina glukózy v krvi sa znova zaznamenávala po každých 30, 60 a 120 minútach. Ako je zrejmé z nižšie uvedenej tabuľky, v porovnaní s kontrolnou skupinou nie sú žiadne rozdiely, a preto sa dá predpokladať, že zvieratá v čase utratenia netrpeli diabetes mellitus (obr. 2.1). Zvieratá sa anestetizovali inhaláciou s izofluránom a potom sa utratili zlomením krku. Tabuľka 2.1: Telesná hmotnosť a hmotnosť ľavej komory zvierat v skupine s obezitou a súvisiacej kontrolnej skupine. Hranica významnosti pre rozdiel medzi týmito dvoma skupinami bola s