Nukleozómy ako parametre bunkovej smrti u pacientov so zhubnými nádormi - PDF na stiahnutie zadarmo

Z Inštitútu pre klinickú chémiu vo Výkonnej rade Ludwig-Maximilians-Universität München: Prof. Dr. DR. h.c. D. Seidel Nukleozómy ako parametre bunkovej smrti u pacientov so zhubnými nádormi Dizertačná práca pre získanie doktorského titulu v odbore medicína na Lekárskej fakulte Univerzity Ludwiga Maximiliána v Mníchove, ktorú predniesol Stefan Holdenrieder z Jettingen-Scheppach 24

II So súhlasom Lekárskej fakulty Mníchovskej univerzity 1. Reportér: Prof. Dr. DR. h.c. D. Seidel, druhý spravodajca: prof. Dr. C. Nerl Spoluspravodajca: Priv. Doz. R. Holle prof. Dr. J. P. Johnson Spoločný dozor PhD zamestnanca: Dr. Dekanka Petra Stieber: prof. Dr. DR. h.c. K. Peter Deň ústnej skúšky: 15.1.24

III Venované mojim rodičom

IV Predchádzajúce publikácie: Prihláška patentu: Roche Diagnostics, Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Busch M, Ready G, Schalhorn A Sledovanie liečby u pacientov, u ktorých je apoptóza indukovaná v dôsledku choroby alebo liečby, detekciou apoptózy Produkty. Číslo patentu: 4918/OA/WO - Ts Pôvodné články: Holdenrieder S, Stieber P, Förg T, Kühl M, Schulz L, Busch M, Schalhorn A, Seidel D Apoptóza v sére pacientov so solídnymi nádormi Anticancer Res. 19: 2721-2724 (1999) Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Ready G, Fürst H, Schmeller N, Untch M, Seidel D Nukleozómy v sére ako marker bunkovej smrti Clin Chem Lab Med 39: 596-65 (21) Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Busch M, Ready G, Fürst H, Schalhorn A, Schmeller N, Untch M, Seidel D Nukleozómy v sére pacientov s benígnymi a malígnymi ochoreniami Int J Cancer (Pred Oncol) 95: 114-12 (21 ) Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Busch M, v Pawel J, Schalhorn A, Nagel D, Seidel D Cirkulujúce nukleozómy v sére Ann NY Acad Sci 945: 93-12 (21) Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Busch M, Ready G, Fürst H, Schalhorn A, Schmeller N, Untch M, Seidel D Kvantifikácia nukleozómov v sére pomocou testu Cell Death Detection ELISA plus Biochemica 1 (22): 25-27

VI OBSAH 1 ÚVOD A OTÁZKY I 2 ZÁKLADNÉ INFORMÁCIE 4 2.1 SMRŤ BUNIEK 4 2.1.1 HISTÓRIA VÝSKUMU SMRTI BUNIEK 4 2.1.2 DICHOTOMICKÝ MODEL SMRTI BUNIEK 1 2.1.3 MODEL INTEGROVANEJ SMRTI BUNIEK 17 2.1.4 SMRŤ BUNIEK VO FYZIOLOGICKÝCH PROCESOCH 21 2.1.5 PROCES 6 GENETICKÁ REGULÁCIA APOPTOTICKEJ SMRTI BUNIEK 28 2.1.7 SIGNÁLNE CESTY SMRTI APOPTOTICKEJ BUNKY 31 2.1.8 INDUKCIA APOPTOTICKEJ SMRTI BUNIEK 4 2.1.9 METÓDA ZISTENIA SMRTI BUNIEK 43 2.2 JADROVINY 57 2.2.1 ŠTRUKTÚRA A FUNKCIA ZUCLEOSOM 58 2.2.3 OBEHY JADROVÝCH KYSELÍN V PLAZME A SÉRE 68 3 METODICKÉ VÝCHODISKÁ SKÚŠKY NUKLEOSOMENTU 8 3.1 IMUNCHEMICKÉ DETEKČNÉ A MERACIE METÓDY 8 3.2 METODICKÝ ZÁKLAD POČIATOČNÉHO SKÚŠKY 82 3.3 ÚPRAVY A NORMALIZÁCIA ANALÝZY 9 3.4 PACIENTI 92 4.1.1 ZDRAVÉ OSOBY 92 4.1.2 PACIENTI S BENIGNENSKÝMI CHOROBAMI 92 4.1.3 PACIENTI S MALIGNANSKÝMI CHOROBAMI 94 4.2 ŠTATISTICKÉ METÓDY 97 4.2.1 HODNOTENIE KLINICKO-DIAGNOSTICKEJ KVALITY 97 4.2.2 ŠTATISTICKÉ POSTUPY V RIADENOM VYŠETROVANÍ 12 4.2.3 ŠTATISTICKÉ POSTUPY V DLHOTINÁCH

3 1. Líšia sa spontánne koncentrácie nukleozómov u zdravých ľudí, pacientov s benígnymi ochoreniami a pacientov so zhubnými nádormi? Je možné diagnostikovať zhubné ochorenia? 2. Líšia sa spontánne koncentrácie nukleozómov v rôznych druhoch nádorov? 3. Líšia sa spontánne koncentrácie nukleozómov z hľadiska nádorových charakteristík, ako sú štádium, grading alebo histológia? 4. Aké zmeny v koncentrácii nukleozómov vyplývajú z operácií, infekcií a následných antibiotík, ako aj z chemoterapie a rádioterapeutickej liečby? 5. Korelujú u ľudí so zhubnými ochoreniami zmeny v koncentrácii nukleozómov vyvolané chemoterapiou a rádioterapiou s klinickou odpoveďou na terapiu a zobrazovacími nálezmi? Je možné vykonať terapeutické sledovanie pomocou nukleozómov? Ako bezpečne a ako skoro je možné hodnotiť účinnosť terapie? 6. Korelujú koncentrácie nukleozómov počas chemoterapie a rádioterapie s inými onkologickými biomarkermi používanými na kontrolu účinnosti liečby? Je porovnateľné alebo spoľahlivejšie hodnotenie terapeutického úspechu možné pomocou nukleozómov?

6 Na začiatku 60. rokov 20. storočia R Lockshin a C Williams použili model hmyzu na štúdium procesov počas bunkovej smrti a zaviedli pojem programovaná bunková smrť ako priestorovo a časovo predvídateľný proces (Lockshin 1964). O niečo neskôr Tata a opäť Lockshin ukázali, že syntéza makromolekúl je pre túto bunkovú smrť nevyhnutná. Dokázali mu účinne zabrániť pomocou inhibítorov RNA a proteínov (Tata 1966; Lockshin 1969). Nakoniec v roku 1971 John F. Kerr opísal takzvanú nekrózu zmršťovania, sled zmien, ktoré pozoroval v jednotlivých odumierajúcich bunkách pečene, ktoré následne po oklúzii portálnej žily potkanov atrofovali (Kerr 1971). John F. Kerr Andrew Wyllie Sir Alastair Currie O rok neskôr predstavil spolu s Andrew Wyllie a Sir Alastair Currie termín apoptóza, termín prevzatý z gréčtiny, ktorý označuje jeseň lístie na jeseň, a ohlasoval novú éru moderny Výskum bunkovej smrti (Kerr 1972). Obrázky 2-4 (Cummings 1997): Prvá osoba popisujúca apoptózu. Obrázky 5 a 6 (Kerr 1994): Apoptotické bunky s typickými morfologickými charakteristikami

9 Obrázok 8: Chronológia výskumu bunkovej smrti

1 2.1.2 Dichotomický model bunkovej smrti Z historických dôvodov sa po zavedení termínu apoptóza Kerrom pôvodne rozlišovalo medzi typmi bunkovej smrti, ktoré sú výsledkom vonkajších a vnútorných stimulov. Bunková samovražda sa rozdelila najmenej na tri typy: ischemická bunková smrť, bunková smrť voľných radikálov a geneticky regulovaná apoptóza (Majno 1995). Ako navrhuje Gräper, druhý tvoril náprotivok mitózy. Nekróza sa pôvodne makroskopicky chápala ako zvyšky mŕtveho tkaniva. Na bunkovej úrovni sa nekróza označovala ako pasívna bunková smrť spôsobená vonkajšími stimulmi, na rozdiel od vnútornej, aktívne uskutočňovanej degradácie buniek, apoptózy. Tieto dve formy sa aplikovali dichotomickým spôsobom na všetky fenomény bunkovej smrti; iné formy bunkovej smrti boli do značnej miery ignorované (Wyllie 198a; Kerr 1994). Obrázok 9: Klasický model bunkovej smrti (upravené od Majno 1995): kondenzácia ruptúry chromatínu bunkového jadra intaktná apoptóza plazmatickej membrány dehydratácia a zmenšenie apoptotických teliesok bunky opuch bunky a ruptúra mitochondrií nekrózy plazmatickej membrány

21 2.1.5 Odumieranie buniek v patologických procesoch Odumieranie a množenie buniek sú v jemne regulovanej rovnováhe v organizme, ako aj v jednotlivých orgánoch a funkčných systémoch. Ak dôjde k narušeniu tejto rovnováhy, môžu sa choroby rozvíjať na všetkých úrovniach: Homeostáza Bunková smrť Proliferácia Prevaha rýchlosti proliferácie nad rýchlosťou bunkovej smrti môže viesť k lokálnym a systémovým malígnym ochoreniam, ako aj k metabolickým, zápalovým a niektorým autoimunitným ochoreniam. Hyperproliferatívne choroby Proliferácia bunkovej smrti Nadmerná bunková smrť je na druhej strane základom pre vývoj veľkého počtu degeneratívnych, hematologických, autoimunitných, ischemických, toxínom sprostredkovaných a zápalových ochorení. Degeneratívne a deštruktívne choroby Proliferácia Bunková smrť Prehľad dôležitosti bunkovej smrti pri rôznych chorobách je uvedený v nasledujúcej tabuľke (Thompson 1995; Fadeel 1999; Robertson 22):

Regulácia signálnych dráh Na zahájenie a implementáciu apoptózy sprostredkovanej receptorom boli identifikované niektoré centrálne dráhy prenosu signálu, ktoré sú spoločné pre všetky bunky, a boli opísané niektoré variabilné úseky, ktoré sa líšia v závislosti od typu bunky a spúšťacieho činidla. Medzi bežné faktory patrí tvorba DISC z trimerizovaných receptorov, FADD a iniciátora prokaspázy 8, ako aj z koncového segmentu efektorových kaspáz, najmä kaspázy 3, ktorá vedie k aktivácii bunkovej štruktúry a proteáz štiepiacich jadro. Medzi nimi sú tri variabilné sekcie: 1. priama aktivácia kaspázovej kaskády 2. zapojenie mitochondrií s uvoľňovaním cytochrómu C 3. aktivácia mitochondrií a uvoľnenie AIF podľa cesty, ktorou sa môžete vydať na uskutočnenie apoptózy možno rozlíšiť dva typy buniek (Scaffidi 1998; Krammer 2a, b): CD95-L CD95-R Obrázok 18: Apoptotické signálne dráhy v bunkách typu I a typu II (upravené z Krammer 2a) FADD/MORT1 DD DD DD DD DD DD FADD Pro - CASP-8 DISC c-flip BID Bcl-2 Bcl-x L CASP-8 Cyto c - Apaf-1 CASP-3 CASP-9 CASP-8 AIF Smrtné substráty TYP I Apoptóza TYP II

Početné inhibítory efektorových kaspáz sú zoskupené ako IAP (inhibítory apoptózy). V ľudských bunkách sem patria XIAP (MIHA), c-iap-1 (MIHB), c-iap-2 (MIHC), NAIP a survivín. Začínajú na aktivovaných kaspázach 3 a 7 a na apoptozóme a významne sa líšia svojou inhibičnou silou. (Cecconi 1999; Budjhardjo 1999, Thornberry 1998; Jäättelä 1999; Deveraux 1999; Goyal 21). Ich význam spočíva pravdepodobne v jemnej regulácii signálu apoptózy. Toto je podporované aj uvoľňovaním ďalších proteínov regulujúcich IAP, ako je Smac (druhý aktivátor kaspáz odvodený od mitochondrií) a DIABLO (proteín viažuci sa na IAP s nízkou pí) (Hengartner 2) počas apoptózy. Najdôležitejšie zložky signálnych dráh apoptózy vrátane inhibičných východiskových bodov sú uvedené nižšie: FADD/MORT1 DD DD DD DD DD CD95-L CD95-R FADD/MORT1 poškodenie DNA p53 Obrázok 19: Prehľad regulácie signálnych dráh v apoptóze (upravené podľa Hengartnera 2 a Rosella 22) Pro- CASP-8 DISC BID Bcl-x L Bax Bcl-2 c-flip Bcl-2 Bcl-x L CrmA CASP-8 cytochróm c Pro-CASP-9 Bcl-x L Pro-CASP -3 APAF-1 apoptozóm CASP-3 IAP Smac/DIABLO AIF substráty smrti apoptóza

62 Helikálne skrútenie superhelixu DNA v nukleozóme, ktorý po uvoľnení kontaktov histón-DNA rozmotá a posúva histónový komplex (Widom 1997; Kornberg 1999). Pre funkciu niektorých z týchto komplexov, napríklad pre faktor remodelovania nukleozómov NURF, je potrebné zapojenie koncov acetylovaného histónu. Prehľad komplexov remodelujúcich kromatín je uvedený v nasledujúcej tabuľke (Kornberg 1999): Promótor P mrna k 12 P nukleozóm k 21 P Skrúcanie DNA a expozícia progresie DNA transkripcie P kompletný prepis Obrázok 26: Remodelácia chromatínu komplexmi ISWI (Widom 1997) Tabuľka 8: Zoskupenie a charakteristika komplexov remodelujúcich chromatín Chromatín remodelačných komplexov Organizmus ATPáza Molekulová hmotnosť (MDa) Podjednotky SWI/SNF rodina SWI/SNF S. cerevisiae SWI2/SNF2 2 11 RSC S. cerevisiae STH1 1 15 Brahma D. melanogaster Brahma 2 ND H SWI/SNF H.sapiens hbrm 2 1 H SWI/SNF H.sapiens BRG1 2 1 NRD H.sapiens CHD4 1,5 18 rodina ISWI I SWI1 S.cerevisiae ISWI1,4 4 I SWI2 S.cerevisiae ISWI2,3 2 NURF D.melanogaster ISWI, 5 4 CHRAC D.melanogaster ISWI, 7 5 ACF D.melanogaster ISWI, 2 4 RSF H.sapiens hiswi, 5 2