Odber dychu od detí pre choroby Protokol o objavení biomarkerov (preložený do nemčiny)

Zhrnutie

Tento protokol popisuje jednoduchú metódu získavania vzoriek dychu od detí. Stručne povedané, vzorky zmiešaného vzduchu sa pred koncentráciou v plynovej chromatografii a hmotnostnej spektrometrii predkoncentrujú v skúmavkách s sorbentom. Pomocou tejto metódy zberu dychu je možné identifikovať biomarkery dychu infekčných a neinfekčných chorôb.

Abstrakt

Úvod

Biomarkery môžu niesť cenné informácie o normálnych a patologických biologických procesoch, ktoré môžu prispieť ku klinicky identifikovateľnému ochoreniu. V poslednej dobe sa zvyšuje záujem o hodnotenie prchavých látok z dychu ako biomarkerov rôznych chorobných stavov vrátane infekcií, metabolických porúch a rakoviny 1. Vydychovaný vzduch obsahuje kvantifikovateľné množstvo prchavých organických zlúčenín (VOC), poloprchavých organických zlúčenín a mikrobiálne odvodeného materiálu (napr. Nukleové kyseliny z baktérií a vírusov). Hlavným cieľom analýzy vydychovaného vzduchu je neinvazívny pohľad na stav choroby a/alebo vplyvy prostredia. Existuje niekoľko metód zberu a analýzy vydychovaného vzduchu, v závislosti od zložiek, ktoré nás zaujímajú. V súčasnosti neexistuje žiadna štandardizovaná metóda prieskumu vydychovaného vzduchu, ktorá by sťažovala komparatívnu analýzu výsledkov štúdií. Štandardizácia postupu odberu dychu je dôležitá, pretože samotný postup odberu vzoriek má významný vplyv na následné výsledky dychu.

V mnohých štúdiách sa používa odber vzoriek dychu z neskorých dýchacích ciest 2, 3. Táto voľba zahŕňa vyradenie prvej časti vydychovaného vzduchu („mŕtvy priestor“), aby sa prednostne zachytil vzduch na konci dychového cyklu. Výhodou tejto stratégie je, že minimalizuje hladinu exogénnych VOC (napr. Ekologických VOC) a zároveň obohacuje endogénne VOC špecifické pre pacienta. Táto metóda zabráni tomu, aby jedinec vydychoval prvých pár sekúnd pred odberom vzorky dychu. Iní vedci použili tlakový senzor na aktiváciu vzorkovania v preddefinovanej fázovej postupnosti 4, 5. Pretože snímače tlaku vyžadujú zložitú technológiu, vyžaduje táto alternatívna metóda vyhradené a relatívne drahé zariadenie na odber vzoriek.

Obzvlášť ťažké môže byť pediatrický odber dychu. Veľkou obavou je, že malé deti nemusia byť schopné pracovať s guľatinou pre dobrovoľný výdych vzduchu „mŕtvy priestor“. Z tohto dôvodu je ľahšie získať zmiešaný dych dýchacích ciest od detí. Dôležitým obmedzením vzoriek dychu zmiešaného s dýchacími cestami je však riziko kontaminácie životného prostredia a materiálu. Realizovateľnosť pediatrického zberu je preto v tejto oblasti hnacím motorom.

Okrem metód zhromažďovania údajov môže zadržiavanie vzorky dychu tiež ovplyvniť kvalitu vzorky. Vysoká vlhkosť v dychu a extrémne nízke koncentrácie (diely na bilión) prchavých organických zlúčenín spôsobujú, že vzorky dychu sú obzvlášť citlivé na problémy spojené s pamäťou 6, 7. Napriek veľkému potenciálu techník v reálnom čase, ako je hmotnostná spektrometria s prenosom protónov (PTR-MS), zostáva GC-MS zlatým štandardom pre analýzu vzoriek dychu. Pretože GC-MS analýza vzoriek dychu je offline technikou, je spojená s predkoncentračnými metódami, ako sú skúmavky s tepelnou desorpciou (TD), extrakcia z mikro-tuhej fázy a zachytávače ihiel. Pred predbežnou koncentráciou musia byť vzorky dychu dočasne uskladnené v polymérnych vreciach 8. Polymérové ​​tašky sú populárne kvôli svojej priemernej cene, relatívne dobrej životnosti a opakovanému použitiu. Aj keď je možné vrecká opätovne použiť, na zabezpečenie efektívneho čistenia je potrebný čas a úsilie 7, 8. Každá konkrétna taška tiež vyžaduje empiricky stanovené a štandardizované postupy kontroly kvality, opätovného použitia a obnovy.

TD trubice sa často používajú na predkoncentráciu dychu, pretože zachytávajú veľké množstvo prchavých látok a je možné ich prispôsobiť. Absorpčné materiály použité na balenie TD skúmaviek môžu vyhovovať konkrétnym aplikáciám a špecifickým cieľovým prchavým látkam, ktoré sú predmetom záujmu. Trubičky TD významne zlepšujú pohodlie štúdií biomarkerov dychu, najmä na odľahlých trávnatých porastoch, pretože trubice TD bezpečne uchovávajú prchavé látky v dychu najmenej dva týždne a ľahko sa prenášajú 3 .

V úsilí štandardizovať pediatrický zber dychu pre objav biomarkerov tu popisujeme jednoduchú metódu zberu dychov od detí. Na ilustráciu reprezentatívnych výsledkov implementovaných protokolov sa anonymizované údaje predkladajú prebiehajúcej skupine detí (vo veku 8 - 17 rokov) pri hodnotení na nealkoholické tukové ochorenie pečene (NAFLD). Úplné výsledky a analýza tejto štúdie budú uvedené v neskoršej publikácii. Pritom podávame správy o podmnožine údajov, aby sme demonštrovali uplatnenie nášho protokolu. Stručne povedané, deti sú poučené, aby normálne vydýchli cez náustok do polymérového vrecka, akoby „fúkali balón“. Proces sa opakuje 2-4 krát, kým sa nezhromaždí 1 liter dychu. Vzorka sa potom prenesie do TD skúmavky a pred analýzou GC-MS sa uskladní pri 5 ° C.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

Štúdiu schválila inštitucionálna kontrolná komisia lekárskej fakulty Washingtonskej univerzity (# 201709030). Pred zápisom do štúdie bol získaný súhlas od rodiča alebo zákonného zástupcu. Fotografie na obrázku 2 reprodukované s písomným súhlasom rodičov.

(3) Prenos dychu do skúmaviek na tepelnú desorpciu

  1. Ihneď po nasatí dychu odoberte vzorky okolitého vzduchu okolo pacienta.
    1. Vrecko položte na výstup čerpadla s hadicou, ako je dovnútra doplnkový obrázok 5zobrazené.
    2. Sklopte driek ventilového vaku nadol a otvorte vstupnú zostavu na odber vzoriek.
    3. Zaistite otvorený ventil otočením ryhovanej vrúbkovanej skrutky na strane prívodnej armatúry v smere hodinových ručičiek.
  2. Zapnite čerpadlo a bežte 12 minút pri 100 ml/min. Čerpadlo zachytí 1 200 ml okolitého vzduchu.
  3. Po nahromadení požadovaného objemu uvoľnite vrúbkovanú vrúbkovanú skrutku na strane prívodnej zostavy jej otočením proti smeru hodinových ručičiek a tlačte na vreteno ventilu, kým nie je prívodná armatúra kompletná.
  4. Uzamknite ventil vrecka otočením ryhovanej skrutky s ryhou v smere hodinových ručičiek na zatvorenej strane vstupnej armatúry.
  5. Odpojte vak od čerpadla.
  6. Rovnaké kroky ako v časti 3. Rozdiel je iba v tom, že sa prenáša prchavé organické zlúčeniny do okolitého vzduchu, nie do dychu.

POZNÁMKA: Podmienky na analýzu vzoriek dychu a vzduchu boli opísané v bode 9.

  1. Analyzujte zhromaždené údaje a identifikujte zlúčeniny na chromatogramoch. Pomocou typických softvérových programov vyhľadajte a vykonajte všetky pripojenia prístroja (obrázok 3A) uznaný. Napríklad dekonvolučná funkcia na identifikáciu zlúčenín. Filtrujte údaje s faktorom veľkosti retenčného okna 80, filtrom výšky hmotnosti ≥100 impulzov a kompozitným filtrom absolútnej oblasti ≥ 500 impulzmi.
  2. Používajte chemické normy pre zlúčeniny identity vo vzorkách dychu a vzduchu. Extrahujte plochu píku bázických iónov záujmových zlúčenín, ako sú izoprén a p-pinén (obrázok 4) a porovnajte prchavé hladiny v dychu a vzduchu.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Reprezentatívne výsledky

V našej štúdii sa v súčasnosti v Detskej nemocnici v St. Louis hodnotili vzorky dychu zhromaždené od 10 detí (vo veku 8 - 17 rokov). Vzorky dychu a okolitého vzduchu (n = 10) sa zbierali spôsobom opísaným vyššie. Vzorky sa analyzovali pomocou plynovej chromatografie, kvadrupólovej hmotnostnej spektrometrie doby letu (GC-QToF-MS) a tepelnej desorpcie, ako je opísané vyššie 9. Po odstránení kontaminantov pozadia viedli implementované protokoly k priemeru 311 prchavých organických zlúčenín (VOC) v každej zo vzoriek zmiešaného vydychovaného vzduchu. V priemere sa vo vzorkách dychu našlo významne viac VOC v porovnaní s kontrolami prostredia/prostredia (311 ± 11,5 oproti 190 ± 12,6, s. 3A.)). Zvýšený počet VOC v dychu v porovnaní s okolitým vzduchom je viditeľne charakterizovaný reprezentatívnymi celkovými iónovými chromatogrammi (TIC) (obr. 3 b.)) porovnať.

Ako miera úspešnej kontroly kvality zberu dychu boli hladiny dvoch VOC bežných pre dych (izoprén a β-pinén) v porovnaní s regulátormi vzduchu Zimmer (obrázok 4)). Isoprén, jeden z najrozšírenejších VOC v dychu, sa zvyčajne nachádza v úrovniach na jednu miliardu (ppb) (131 ppb), zatiaľ čo β-pinén sa nachádza v hladinách subppb (0,59 ppb) 6. Obidve zlúčeniny sa nachádzajú v dychu zdravých dospelých jedincov v porovnaní s nízkymi hladinami vo vzduchu v interiéri, čo naznačuje, že normálne fyziologické procesy sú obohatené ako primárny zdroj pre tieto analyty v dychu 6. V tom čase bol izoprén (m/Z 67) zadržaný po dobu 2,12 minúty a p-pinén (m/Z 93) bol zadržaný po dobu 14,4 minút. Zistili sme, že početnosť izoprénových detských vzoriek dychu bola 10-krát vyššia ako v regulátoroch vzduchu v miestnosti (obr. 4; priemerná plnosť ± SEM sú 4,2x105 ± 1,0x105 a 3,9x104 ± 0,9x104 pre dych a vzduch ap = 0,0003) a β-pinén vykazoval 3-krát vyššiu plnosť v dychu ako vzduch (moja plnosť ± SEM sú 3,0x104 ± 1,3x104 a 9,1x103 ± 1,6x103 pre dych a vzduch p = 0,007), potvrdzuje úspešný odber dychu. Kompletná popisná analýza nálezov Biomarker Discovery z tejto štúdie bude uvedená v budúcej publikácii.

protokol
Obrázok 1: Vzorkovač dychu a vak na zhromažďovanie vydychovaného vzduchu dohromady. Vzorkovač dychu (s otvoreným modrým ventilom, t. J. Označeným obojstrannou červenou šípkou rovnobežnou so zástrčkou) a vak spojený s hadicou, dych pripravený na odber. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

detí
Obrázok 2: Dieťa vydychujúce dych vo vaku na zber dychu. (A.) Dieťa so vzorkovačom dychu, výdych a (B.) ponúka vo vrecku vzorku dychu. Zdvorilostná fotka. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

detí
Obrázok 3: Vydychované dychové prchavé látky. (A.) Počet rôznych prchavých zlúčenín v každej vzorke dychu od pediatrických pacientov (n = 10) a kontroly okolitého vzduchu (n = 10). Zobrazia sa priemery a štandardné chyby priemeru (SEM). (B.) Celkový iónový chromatograf (TIC) reprezentatívnych pediatrických vzoriek dychu v porovnaní s kontrolou vzduchu na vizualizáciu. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

detí
Obrázok 4: Množstvo dvoch vydychovaných prchavých látok zo vzduchu. Množstvo izoprénu a β-pinénu vo vzorkách dychu od pediatrických pacientov (n = 10) a vzduchových regulátorov Zimmer (n = 10). Plnosť kvantifikovaná plochou píku iónovej bázy. Zobrazí sa stredná hodnota a SEM. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Doplnkový obrázok 1: Vzorkovač dychu. Vľavo: (A) Zberač vzoriek dychu je zostavený spolu: 1) zástrčka + konektor (2) dvojcestný guľový ventil + 3) teflónový adaptér. (B) Kartónový náustok. (C) hadica s malým a veľkým priemerom. Vpravo: Vzorkovač dychu s pripojeným náustkom a hadičkami. Kliknutím sem stiahnete tento súbor.

Doplnkový obrázok 2: Rôzne objemy dychu. Vyššie sú uvedené obrázky odberového vaku naplneného rôznymi množstvami vzduchu (1 L, 2 L a 2,5 L) ako vizuálne znázornenie približných objemov dychu, ktoré sa majú odobrať. Kliknutím sem stiahnete tento súbor.

Doplnkový obrázok 3: Ventil na vrecku. Vľavo: vreteno ventilu je dole (vreckový ventil je otvorený). Uzamknite ventil vrecka otočením ryhovanej skrutky s ryhou v smere hodinových ručičiek na zatvorenej strane vstupnej armatúry. Taška je pripravená na zachytávanie dychu. Vpravo: Vreteno ventilu je hore (vrecko ventilu je zatvorené). Kliknutím sem stiahnete tento súbor.

Doplnkový obrázok 4: Prenos dychu. Vľavo: Sorbentná trubica (1) pripevnená k jednému koncu vaku s hadičkou malého a veľkého priemeru a na druhom konci k pumpe. Vpravo: Poznamenajte si drážkovaný koniec na trubici sorbentu; drážkovaný koniec by mal smerovať k zbernému vrecku. Kliknutím sem stiahnete tento súbor.

Doplnkový obrázok 5: Zber okolitého vzduchu. Vľavo: Čerpadlo s dvoma pripojeniami: vstup a výstup. Výstupný otvor je súčasťou zbernej tašky. Vstupný otvor nasáva okolitý vzduch a prenáša ho do vaku. Vpravo: Systém zberu okolitého vzduchu je nastavený. Kliknutím sem stiahnete tento súbor.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Diskusia

Napriek významnému pokroku vo výskume dychu za posledné desaťročie zostávajú nedefinované štandardizované postupy pre odber vzoriek a analýzu prchavých plynov. Jedným z hlavných dôvodov tohto nedostatku štandardizácie bola rozmanitosť metód zberu údajov o dychu, ktoré majú priamy vplyv na výslednú chemickú diverzitu v ktorejkoľvek vzorke vydychovaného vzduchu. Exhalát Atem obsahuje širokú škálu prchavých organických zlúčenín vo veľmi rôznych koncentráciách 6. Zmena metód zisťovania preto nezmení iba množstvo, ale aj rozmanitosť látok, ktoré môžu byť vo vzorke.

Odber vzoriek dychového plynu je prekvapivo zložitý. Zatiaľ čo subjekty musia pred analýzou vydychovať do náustku zberača alebo do plynotesnej nádoby, odber vzoriek dychu musí brať do úvahy a brať do úvahy množstvo možných premenných. V tejto práci demonštrujeme konkrétny, validovaný protokol pre plynovanie dychu u detí. Doteraz sme úspešne implementovali tento protokol s horúčkovitými deťmi vo veku 4 rokov, v terénnom scenári v prostredí s obmedzenými zdrojmi (Malawi), slnečnej energie v našom dychovom prieskume a analýze potrubí na objavovanie biomarkerov. Ďalej sme implementovali a vyhodnotili naše protokoly na odber vzoriek dychu od hodnotených detí na modernej doplnkovej pediatrickej klinike v USA. Naše výsledky naznačujú, že pre identifikáciu detských biomarkerov detského dychu je zber zmiešaného vzduchu rozhodujúci, pretože poskytuje skutočný „dych“ od daného jedinca. Okrem toho je zmiešaný výdychový dych tiež najjednoduchším typom dychu, ktorý je možné dosiahnuť, pretože sa získavajú všetky fázy vydychovaného vzduchu (ústa a nos) 3.

V teréne, a najmä keď sú subjekty akútne choré, môže byť ťažké kontrolovať bežné látky, ktoré spôsobujú zmätok, ako je strava, telesná teplota a/alebo použitie parfumov alebo krémov s konkrétnym subjektom. Tieto faktory môžu mať výrazný vplyv na objem a kvalitu dychu. Z tohto dôvodu odporúčame vyšetrovateľom nielen zaznamenávať čas zachytenia dychu a dodania do trubičiek sorbentu, ale zvážiť aj ďalšie faktory špecifické pre pacienta, ako je strava (napr. 24-hodinová diéta), používanie ústnej vody a užívanie liekov, osobitne vyhodnotiť účinky týchto potenciálnych zmätkov počas objavovania biomarkerov a následných analýz.

Vdychované zlúčeniny z okolitého vzduchu tiež ovplyvňujú zloženie vydychovaného vzduchu, čo môže predstavovať výzvu pre snahy o objavenie biomarkerov v dychu. Analýza a záznam okolitého vzduchu preto poskytujú kritickú kontrolu a dôležité poznatky o pôvode vydychovaných vzdušných prchavých látok. Napríklad na stanovenie toho, či je konkrétny dych prchavý pri vyššej alebo nižšej plnosti dychu v porovnaní s okolitým vzduchom 11, sa použili prchavé profily okolitého vzduchu. Konkrétna zložka dychu sa preto považuje za odvodenú z vnútra tela (napr. Endogénneho pôvodu), ak je koncentrácia vyššia v dychu ako vo vzduchu, zatiaľ čo nižšia koncentrácia v dychu naznačuje, že táto látka bola odvodená z prostredia (napr. exogénny pôvod). Porovnanie množstva prchavých látok v dychu a vzduchu v interiéri slúži tiež ako dôležitá pozitívna kontrola toho, či je dýchanie adekvátne. Rovnako ako v našich reprezentatívnych údajoch (obrázok 4) preukázali, že prchavá zlúčenina izoprén je endogénneho pôvodu a mala by byť prítomná vo vzorkách dychu v koncentráciách> 10-krát vyšších ako v okolitom vzduchu 6 .

Pri objavovaní biomarkerov sa musia volatilné profily ľudí so záujmovými podmienkami porovnávať s vyváženou zdravou kontrolnou osobou, aby bolo možné vzory identifikovať pomocou štatistických metód, ako je strojové učenie a analýza viacerých premenných. Tu opísanú metódu zhromažďovania dychu možno použiť na rôzne patologické stavy; jedinou požiadavkou je, aby dieťa dobrovoľne odoberalo vzorky dychu. Pretože dychové testy sú neinvazívne, jednoducho sa opakujú a rovnajú sa arteriálnym koncentráciám biologických látok, je veľkým prísľubom pre implementáciu do testov point-of-care na klinické použitie.

Budúca práca sa zameria na vývoj nových metód odberu dychu u malých kojencov a detí (vyžaduje sa predplatné. Prosím, odporučte JoVE svojmu knihovníkovi.

Zverejnenie

Autori nič neprezradili.

Poďakovanie

Ďakujeme deťom a rodinám Detskej nemocnice v St. Louis, ktoré sa zúčastnili tejto štúdie. Uznávame jedinečné úsilie pani Stacy Postmy a pani Janet Sokolichovej počas zbierky dychu. Túto prácu podporuje Nadácia detskej nemocnice St. Louis.