Orálna intubácia dospelých jedincov Zebrafish Model pre hodnotenie intestinálneho absorpcie bioaktívnych zlúčenín

Zhrnutie

Protokol popisuje sondu zebrafish dospelú s biologickým; potom vykonajte disekciu a pripravte cytometriu, konfokálnu mikroskopiu a qPCR črevo. Táto metóda umožňuje hospodárenie s bioaktívnymi látkami sledovať črevné vychytávanie a vyvolaný miestny imunitný stimul. Je dôležité skúmať črevnú dynamiku orálnej profylaxie.

Abstrakt

Úvod

V biomedicínskom kontexte sa vyvíja model na testovanie biologických účinkov zlúčenín po orálnej intubácii. Mnoho anatomických a fyziologických vlastností čreva je zachovaných medzi bilaterálnymi líniami s cicavcami a kostnými rybami 11. Tento model orálnej intubácie spojený s následnou analýzou môže byť nástrojom na získanie poznatkov o ľudskej biológii, ako aj na testovacie pole pre biologiká alebo iné látky in vivo.

Protokol orálnej intubácie môže vykonať jeden operátor, napríklad úspešné podanie až 50 ul suspenzie proteínových nanočastíc s hmotnosťou 1 g s vysokou mierou prežitia pri rybolove. Tento proces je ľahko nastaviteľný a rýchly; 30 rýb môže byť intubovaných za 1 hodinu. Protokol pre prípravu čreva je kľúčom k poskytnutiu bunkových vzoriek a k neskoršej analýze. Príklady následných výsledkov, ktoré demonštrujú protokol užitočný pri získavaní údajov týkajúcich sa absorpcie v čreve a kvalitnej RNA pre izolát qPCR. Protokol by bol veľmi užitočný pre tých, ktorí majú vhodný model na testovanie dynamiky orálnej profylaxie alebo iných zlúčenín v čreve.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

Všetky experimentálne postupy zebrafish (Danio Rerio) boli povolené etickou komisiou Universitat Autònoma de Barcelona (CEEH číslo 1582) v súlade s medzinárodnými hlavnými zásadami pre výskum na zvieratách (. EU 2010/63). Všetky experimenty so živými zebričkami sa uskutočňovali pri 26-28 ° C.

1. Pripravte vybavenie na orálnu intubáciu

  1. Asi 31 cm jemnej silikónovej tuby položte na 31 G Luer lock ihlu tak, aby zakrývala koniec ihly.
  2. Odrežte 10 µL sterilnej filtračnej špičky pipety (približne 2 cm), vezmite jemnejší koniec a položte ju cez silikónovú hadičku ako kryt. Dbajte na to, aby hrot ihly vyčnieval z pipety, aby nedošlo k poraneniu zvieraťa.
  3. Vložte ihlu do 100 ul injekčnej striekačky Luer Lock.
    POZNÁMKA: Opláchnite etanolom a potom soľným roztokom pufrovaným fosfátmi (PBS, pozri materiálov) dôkladne medzi liečbami.

(2) požadované riešenia

  1. Pripravte 150 mg/l (na anestéziu) alebo 300 mg/l (na eutanáziu) roztok etyl-3-aminobenzoát-metánsulfonátu (MS-222) s vodou z akvária, kde je starostlivosť o zebričku. Naplňte malú nádobu 1 L anestetického roztoku a udržujte ju vetranú.
  2. Naplňte ďalšiu malú nádobu 1 l akváriovej vody bez regenerácie rýb MS-222 a udržiavajte ju prevzdušnenú.
  3. Pripravte 50 ml 1x PBS z 10x sterilného zásobného roztoku.
  4. Cytometrická analýza/izolované črevné bunky Pripravte dostatok čerstvého 0,15% roztoku kolagenázy typu IV na 1 ml na rybu zo zásobného roztoku alebo prášku v Dulbeccovom modifikovanom orlom médiu (DMEM) s 1% V/V penicilínom a streptomycínom (pozri materiál). Pripravte alikvotné podiely (1 na rybu) z 1 ml v 2 ml centrifugačných skúmavkách. Pred disekciou držte krok pri 4 ° C až 30 minút.
  5. Na zafixovanie konfokálnej mikroskopie/vzorky pripravte 50 ml čerstvého 4% roztoku paraformaldehydu (PFA) s PBS pufrom alebo rozmrazte zásobný roztok v mrazničke na -20 ° C v parnom digestore.
    Upozornenie: PFA je toxický. Pred prácou s ním si prečítajte kartu bezpečnostných údajov. Mali by ste nosiť rukavice a ochranné okuliare a roztoky vždy nechať v digestore.

3. Výroba suspenzie fluorescenčných nanočastíc

4. Zebrafish anestézia a orálna intubácia

5. Črevná disekcia zebra

7. Pripravte intestinálne kryosekcie na konfokálnu mikroskopiu

8. Príprava vnútorností na qPCR v reálnom čase (RT-qPCR)

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Reprezentatívne výsledky

Zebričky zmiešané so sexom (priemerná hmotnosť: 1,03 ± 0,16 g) boli úspešne intubované rôznymi nanočasticami rekombinantného proteínu (bakteriálne inklúzne telieska) pomocou nášho domáceho zariadenia na orálnu intubáciu (obrázok 1)). Úspešne sme vykonali orálnu intubáciu a dosiahli sme nízke priemerné percento úmrtnosti (6,8%) (stôl 1). Zebrafish boli intubované buď s 30 ul alebo 50 ul suspenzií nanočastíc a bola vypočítaná úmrtnosť do 24 hodín po intubácii. Pokusy boli vykonané dvoma operátormi, R mal menšie skúsenosti s manipuláciou so zebrafish orálnou intubáciou ako J. Výsledky ukázali, že aj nový operátor mohol nezávisle vykonať experimenty s orálnou intubáciou a ľahko dosiahnuť vysokú mieru prežitia prostredníctvom tohto protokolu. Z našich skúseností je optimálna veľkosť rýb 1 g, úspešne sme však intubovali iba 0,5 g.

Aby sme lepšie pochopili, či je zebrafish fluorescenčnou nanočasticou IBs TNF eine (rekombinantný cytokínový proteín nanostruktúrovaný ako inklúzne telieska), prešla našou metódou a absorbovala sa v čreve zebrafish, alebo nie, vykonali sme cytometrickú analýzu. Nanočastice (100 ug/ryba, 50 ul) a PBS (kontrola) sa podávali orálne zebrafishovi (intubáciou) a črevo sa pitvalo 5 hodín a 24 hodín po intubácii. Celkové črevné bunky boli pripravené z kroku 6 a analyzované detekciou fluorescenčného emisného signálu. Reprezentatívne histogramy intenzity fluorescencie a bodové grafy percentuálneho podielu fluorescenčných buniek sú uvedené na obrázku 2zobrazené. Hustota fluorescenčných buniek je výrazne vyššia v skupine intubovanej s nanočasticami v porovnaní s kontrolnou skupinou za 5 hodín a 24 hodín (obr. 2)A.). Percentuálne zastúpenie fluorescenčných buniek je signifikantne vyššie za 5 hodín (46,3%) a 24 hodín (43,0%) v intubovaných skupinách nanočastíc (obrázok 2)B.).

Na ďalšie štúdium, ktorá časť črevnej vrstvy sa podieľa na absorpcii nanočastíc, sme vykonali konfokálnu mikroskopickú analýzu. Nanočastice (20 ug/ryba, 50 ul) a PBS (kontrola) boli orálne intubované na zebrafish a črevo bolo rozrezané 5 hodín po intubácii. Časti čreva boli po kroku 7 zmrazené v tkanivovej procedúre(Obrázok 3)pripravené. Konfokálne obrázky fluorescenčných nanočastíc v čreve sú znázornené na obrázku 3B.zobrazené. Fluorescenčné nanočastice sa našli v črevách zebričiek. Pozorovali sme fluorescenciu v epitelových bunkách, lamina propria a svalových bunkách.

Aby sme skontrolovali, či môžeme pomocou nášho protokolu extrahovať vysoko kvalitnú RNA, analyzovali sme RNA extrahovanú z čreva pomocou bioanalyzátora (tu sa označuje aj ako analyzátor RNA). Zebrafish sa orálne intuboval s PBS (50 ul) alebo nanočasticami (20 ug/ryba, 50 ul). Črevá sa rozrezali na extrakciu RNA 24 hodín po intubácii. Máme sedem vzoriek RNA na testovanie pomocou analyzátora. Zistili sme, že všetky testované vzorky RNA mali vysoké počty integrity RNA v rozmedzí od 7,9 do 8,9 (obrázok 4).

jedincov

ilustrácia 1 : Perorálna intubačná pomôcka. (A.) Obrázok 31 G ihly Luer Lock na 100 µL injekčnej striekačke so silikónovou hadičkou a koncom špičky pipety pripevneným cez hrot ihly. (B.) zväčšený obrázok ihlovej časti. Čierna šípka označuje, že hrot pipety presahuje koniec hrotu ihly. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

intubácia

Obrázok 4 : Obrázok virtuálneho gélu analyzátora RNA zobrazuje RNA extrahovanú zo 7 čriev zebričiek naskenovaných po intubácii. Čísla vzoriek 1 a 2 sú skupiny PBS intubované a čísla vzoriek 3 až 7 sú nanočasticové intubované skupiny. Čísla integrity RNA (RIN) sú uvedené v spodnej časti od 7,9 do 8,9. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

operátor objem # Ryby sú intubované Stredna vaha
(g ± SD)		 # Úmrtia Úmrtnosť (%)
R. 30 ΜL 22 0,88 ± 0,14 3 13.6
R. 30 ΜL 17 0,93 ± 0,19 0 0
J 50 ΜL 19 1,23 ± 0,31 1 5.2
J 50 ΜL 30 1,08 ± 0,40 2 6.6
Všetko vo všetkom 88 1,03 ± 0,16 6. 6.8
SD: štandardná odchýlka priemeru

Stôl 1: Porovnanie úmrtnosti zebrafejej spôsobené dvoma operátormi používajúcimi protokol. Zobrazí sa identifikačný kód operátora, intubovaný objem, počet rýb a hmotnosť rýb v gramoch (g).

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Diskusia

Tento protokol predstavuje zdokonalenie predtým opísanej techniky na orálnu intubáciu od Collymora a kol. 4 náš protokol podrobne popisuje metódu orálnej intubácie a zahŕňa prípravu čreva na následnú analýzu. Naša metóda zlepšuje rýchlosť manipulácie s rybami tak, aby jedna osoba mohla vykonať celý protokol rýchlo a bez veľkých rozdielov medzi operátormi. Zásadný rozdiel oproti nášmu protokolu s predchádzajúcim je ten, že úspešnosť experimentu s orálnou intubáciou hodnotíme nielen sledovaním pohody (napr. Bez krvácania) a úniku podanej tekutiny, ale aj kontrolou príjmu zvieraťa. bioaktívnych nanočastíc v čreve s následnou analýzou (cytometria, konfokálna mikroskopia a qPCR). Ukazujeme, že v čreve sa našli intubované nanočastice označené penetrantom.

Obmedzeniami našej štúdie sú veľkosť rýb, pretože sme netestovali podávanie u rýb menších ako 0,5 g a použitie chemického anestetika na upokojenie zvierat. Niektorí autori používajú na anestéziu zebrafej studenú vodu (0-4 ° C), ale z hľadiska dobrých životných podmienok zvierat a európskeho právneho hľadiska sme sa rozhodli, že metódou voľby bude MS-222.

Zebrafish ponúka oproti iným modelovým systémom mnoho výhod, vrátane kompletnej sady genetických údajov a dostupných transgénnych línií. Pre imunológov poskytujú transgénne línie (napr. SF Mpx: GFP a Tg Mpeg1: GFP) scénu na pozorovanie in vivo imunitných buniek, ako sú makrofágy a neutrofily 19, 20. Kombinácia našej orálnej intubácie a následnej analýzy s transgénnymi líniami by bola ideálna na identifikáciu typov buniek zapojených do absorpcie, transportu a spracovania perorálnych vakcín, nanočastíc a patogénov v rybách.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Zverejnenie

Autori vyhlasujú, že nejde o konflikt záujmov.

Poďakovanie

Táto práca bola podporená z grantov španielskeho ministerstva vedy, Európskej komisie a prostriedkov AGAUR pre NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER a 2014SGR-345 AGAUR). RT je držiteľom doktorandského grantu od AGAUR (Španielsko), JJ bol podporený doktorandským grantom Čínskej štipendijnej rady (Čína) a NR je založená na programe Ramón y Cajal (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Ďakujeme Dr. Torrealba za príslušné poradenstvo v oblasti výroby bielkovín, N. Barba zo spoločnosti „Servei de Microscopia“ a Dr. M. Costa z „Servei de Citometria“ Universitat Autònoma de Barcelona za užitočnú technickú podporu.