Povrchová funkcionalizácia nanočastíc pre cielenú interakciu s biomolekulami - PDF
1 Povrchová funkcionalizácia nanočastíc pre cielenú interakciu s biomolekulami Dizertačná práca na získanie akademického titulu doktor prírodných vied (Dr. rer. Nat.) Predložené na Katedre biológie, chémie, farmácie Slobodnej univerzity v Berlíne predloženej Dipl.-Chem. Meike Roskamp z Papenburgu január 2010
2 1. recenzent: Prof. Dr. Sabine Schlecht 2. recenzent: Prof. Dr. Hans-Ulrich Reissig spor o
4 Dr. Chcel by som sa poďakovať Jensovi Derneddovi za príjemnú spoluprácu pri výskume nanočastíc viažucich selektín a pri vyšetrovaní toxicity nanočastíc. Chcem poďakovať Ilone Pappovej za dobrú spoluprácu a veľkú ochotu pomôcť. Ďalej by som sa chcel poďakovať všetkým servisným oddeleniam Ústavu pre chémiu a biochémiu, najmä Dr. Johann Spandl za oboznámenie s IR spektrometrom a Rita Friese za vykonanie TGA. Chcel by som poďakovať Michaelovi Stasiakovi za korektúru tejto práce a za morálnu podporu počas písania. Chcel by som poďakovať študentkám Nelly Rivas, Franziska Buchner, Kathera Hazin, Mareike Noah a Christina Lüders za ich syntetickú podporu. Chcel by som poďakovať svojej najlepšej priateľke Annette Brunsenovej za podporu, ktorú vždy poskytovala napriek veľkému odstupu a jej pozitívnemu vplyvu na moje organizačné schopnosti. Ďakujem svojim rodičom za podporu, na ktorú som sa vždy mohol spoľahnúť. Ďakujem Fritzovi Wilhelmovi Wernickemu za skrášlenie refluxného chladiča, malé poznámky na mojom stole a prehliadky mesta, za podporu a trpezlivosť.
5 Obsah Obsah 1 Motivácia 7 2 Úvod do pracovnej oblasti Syntéza a charakterizácia nanočastíc Syntéza nanočastíc Charakterizácia nanočastíc Povrchová funkcionalizácia nanočastíc Reakcie výmeny ligandov Reakcie na periférii ligandu Adsorpcia molekúl na obale ligandu Kombinácia niekoľkých metód povrchovej funkcionalizácie Viacrozmerné nanočastice Prehľad toxicity v pokrytej oblasti medicíny 40 3 Výsledky a diskusia Syntéza nanočastíc Syntéza a charakterizácia Au koloidov Syntéza a charakterizácia Ag koloidov Syntéza a charakterizácia Au/Ag-zliatinových koloidov Syntéza a charakterizácia CdS koloidov Peptidmi indukované Agregácia nanočastíc Štruktúra a vlastnosti použitých peptidov Nabité nanočastice ako stavebné prvky elektrostatického usporiadania Správa a stabilita nanočastíc v pufri VW05 indukované usporiadanie záporne nabitých NP Nanočastice vyvolané vytváranie vlákien Nanočastice viažuce selektín 109 5
6 Obsah Závislosť inhibície na stupni sulfatácie Reprodukovateľnosť hodnôt IC50 Vplyv štruktúry väzbového ligandu Vplyv peptidovej väzby Vplyv dĺžky reťazca Vplyv veľkosti nanočastíc Porovnanie vplyvu skúmaných faktorov na hodnotu IC50 Štúdie TEM Bunková toxicita NP Imobilizácia NP v Polymérové vlákna Zhrnutie a výhľad Zhrnutie Experimentálna časť Skratky Rozpúšťadlá a reagencie Syntézy NP syntézy Ligandové výmenné reakcie Kovalentná modifikácia NP syntéz ligandov Použité prístroje a metódy merania Dialýza Gélová elektroforéza NMR spektrometer IR spektrometer Termogravimetrická analýza (TGA) Transmisný elektrónový mikroskop (TEM) UV/Vis- Spektrometer Kompetitívne väzobné testy založené na SPR Bibliografia Príloha 216 6
23 2 Úvod do pracovnej oblasti Obrázok 2.7: Produkcia lipázou koordinovaných Au nanočastíc pomocou klikovej chémie [77]. Štúdiu kinetiky 1,3-dipolárnej cykloadície medzi azidom a alkínom na povrchu NP zlata uskutočnili Thode a Williams (schéma pozri obrázok 2.8) [79]. Okrem rozpúšťadla sú to substituenty na alkínketóne, dĺžka reťazca linkera, tj. H. spojovacia časť molekuly medzi azidovou skupinou a povrchom NP a hustotou azidových skupín na povrchu častíc. Komplexné porovnanie medzi reakciou v roztoku a na povrchu častíc sa neuskutočnilo, ale konverzné pomery sa zdajú byť veľmi podobné [80]. Je zaujímavé, že zmena hustoty obsadenia funkčných skupín na povrchu častíc mala väčší vplyv na získaný výťažok ako ktorýkoľvek iný parameter skúmaný v tejto štúdii. Obrázok 2.8: Všeobecná schéma tvorby triazolov na NP zlata [79]. 23
45 2 Úvod do oblasti glykokonjugovaných nanočastíc zlata [153, 157] a nanočastíc sulfidu kademnatého [158] a boli preskúmané ich antiadhézne vlastnosti alebo v prípade polovodičových nanočastíc ich vhodnosť na označovanie buniek. Cieľom tejto pracovnej skupiny je lepšie pochopenie interakcií sacharidov a sacharidov [159], ale aj vplyv procesov adhézie buniek a buniek sprostredkovaných sacharidmi, ako je napríklad zápalový proces. Polymérne častice môžu tiež slúžiť ako nosiče pre mono- a ligosacharidy. Haag a kol. v roku 2008 ukázali, že častice polyglycerolu funkcionalizované galaktózou sú schopné inhibovať väzbu selektínu [160]. Okrem závislosti na stupni funkcionalizácie častíc táto práca tiež zistila zreteľné zlepšenie väzbových vlastností po sulfatácii zvyškov galaktózy. Toto pozorovanie sa zhoduje s prácou Linhardta a kol. pozorovania pre heparín (pozri vyššie). 45
67 []/(10 3 degcm 2 dmol -1 zvyšok -1) 3 Výsledky a diskusia VW19 RR/nm Obrázok 3.25: CD spektrá 50 um VW19 a 50 um RR01 pri pH 7,4. Podrobnejší opis štruktúr VW19 a RR01 ako funkcie koncentrácie a hodnoty ph možno nájsť v publikáciách Pagel et al. možno vziať z [182, 183]. Tabuľka 3.5 ukazuje vypočítaný čistý náboj peptidov ako funkciu hodnoty ph. VW19 je pozitívne nabitý pod pH 10 a negatívne nabitý nad ním. RR01 je už záporne nabitý od cca Ph 5. Zatiaľ čo VW19 má preto pozitívny čistý náboj v neutrálnych roztokoch a bude tak vstupovať do atraktívnych elektrostatických interakcií so záporne nabitými NP, RR01 má záporný čistý náboj v tomto rozmedzí pH, čo naznačuje odpudivé elektrostatické interakcie so záporne nabitými NP. Pre kladne nabité NP platí opak. Pri RR01 sa v tomto rozmedzí hodnôt ph vyskytujú atraktívne elektrostatické interakcie, zatiaľ čo u VW19 sa dajú očakávať odpudivé elektrostatické interakcie. Tabuľka 3.5: Čistý náboj peptidov VW19 a RR01 pri rôznych hodnotách ph [179]. hodnoty ph čistý náboj VW19 [e/peptid] čistý náboj RR01 [e/peptid]
88 3 Výsledky a diskusia Obrázok 3.43: TEM obrázky z MUDS coord. Au-NP (d = 6 nm) pri pH 9 v 10 mm pufri Tris/HCl (a) bez a (b, c a d) s 10 um VW05. Zatiaľ čo NP bez peptidu boli izolované a distribuované relatívne rovnomerne na TEM mriežke, bolo možné pozorovať jasnú agregáciu častíc v prítomnosti 10 um VW05. Okrem agregátov peptidu NP s veľkosťou niekoľkých 100 nm možno pri tejto koncentrácii a príprave peptidu nájsť aj niektoré jednotlivo ležiace NP. V porovnaní s TEM snímkami z predbežných testov (obrázok 3.40) sa zdá, že štruktúra agregátov má miestami určitý rád krátkeho dosahu (pozri obrázok 3.43 d), ale napriek významne zlepšenej disperzite častíc tu nie je rád diaľkového dosahu. Sušenie vzorky počas prípravy mriežky môže viesť k agregačným účinkom, ktoré sa v roztoku nevyskytujú. Takto pripravené vzorky preto umožňujú iba obmedzené závery o situácii 88, pokiaľ ide o stav agregácie komponentov
89 3 Výsledky a diskusia v riešení. Odstránenie rozpúšťadla môže tiež viesť k zrúteniu usporiadaných štruktúr, ak, ako je známe z agregátov NP-DNA [104], vysoké percento štruktúry zaberajú molekuly rozpúšťadla. Teda stupeň poriadku agregátov NP-peptidu v roztoku nemusí nevyhnutne zodpovedať stupňu na takto pripravených TEM snímkach. Záznamy kryo-TEM majú výhodu v tom, že vzorka nie je vysušená, ale zmrazená, takže vzorka je v stave porovnateľnom s roztokom, pokiaľ ide o vzdialenosti medzi komponentmi prítomnými počas merania. Kryo-TEM obrazy súradnice MUDS. Au-NP a VW05 pri pH 9 sú znázornené na obrázku 3.44 a v podstate poskytujú rovnaké výsledky, pokiaľ ide o agregačné správanie NP a ich stupeň poriadku v agregátoch, ako je to znázornené na obrázku 3.43. Obrázok 3.44: Kryo-TEM obrázky 0,05 um koordínu MUDS. Au-NP (d = 6 nm) pri ph 9 a rôznych zväčšeniach (a a b) bez VW05 a (c a d) s 10 um VW05. 89
Na to, aby bolo možné pracovať na výsledkoch a diskutovať, by preto bola potrebná zmena rozpúšťadla. Pokusy o to už v rámci tejto práce neboli možné. Obrázok 3.46: TEM obrazy zmesi 0,05 um koordínu MUDS, ktorý bol temperovaný na 80 ° C. Au-NP a 10 um VW05. Ďalšie zaujímavé pozorovanie sa uskutočnilo pri spracovaní zrazeniny ultrazvukom. Predtým purpurový, zakalený roztok sa stal čírym a červeným opäť pôsobením ultrazvuku. Fotografie suspenzie agregátov pred a po liečbe ultrazvukom sú zobrazené na obrázku 3.47. Po krátkej dobe (asi 10 minút) zrazenina a fialová farba ustúpili. Doposiaľ nebolo objasnené, či je tento proces spôsobený iba mechanickým rozdrobením agregátov alebo zmenou peptidovej konformácie vyvolanou ultrazvukom. Obrázok 3.47: Fotografie zmesi 0,037 um koordínu MUDS. Au-NP s 10 um VW05 (a) pred a (b) po približne 20 sekundách pôsobenia ultrazvuku. 92
94 3 Výsledky a diskusia h, 6 h, 20 h max/nm c (sr05)/M Obrázok 3.49: Absorpčné maximá 0,05 um MUDS. Au-NP v závislosti na koncentrácii SR05 pri pH 9 (tlmivý roztok Tris/HCl 10 mm) priamo po zmiešaní zložiek a po 6 hodinách a 20 hodinách. Boli pozitívne elektrostatické interakcie medzi pozitívne nabitým peptidom SR05 a negatívne nabitými NP, ktoré viedli k miernemu zvýšeniu absorpcie v absorpčných spektrách (pozri obrázok 3.49 a spektrá v prílohe, časť 8.1.5) a k miernemu zvýšeniu gélovej elektroforézy. Spomalenie NP pásov so zvyšujúcou sa koncentráciou peptidu (pozri obrázok 3.50). Na rozdiel od testov s VW05 však nebolo možné pozorovať žiadnu tvorbu zrážok a žiadny významný posun v absorpčnom maxime. Obrázok 3.50: Gélová elektroforéza na zmesiach MUDS koordinovaných Au-NP a SR05 pri pH 9, vľavo hore: agarózový gél vystavený bielemu svetlu, vľavo dole: agarózový gél vystavený 254 nm UV žiareniu, vpravo: tabuľka s miešacími pomermi použitých vzoriek. Poloha vreciek je označená červenou čiarou. 94
129 3 Výsledky a diskusia NP11 sa funkcionalizoval s enantiomérom amínu imobilizovaného na NP10 a potom sa sulfatoval. Hodnoty IC50 týchto dvoch koloidov (pozri tabuľku 3.10) pre L aj P selektín sa navzájom významne nelíšia. Enantioméry majú teda v tomto príklade rovnaké väzbové vlastnosti. Tabuľka 3.11 ukazuje hodnoty IC50 pre ďalšie dva koloidy funkčné s aminopyranom. NP12 a NP13 sa líšia v prítomnosti síranovej skupiny (v tabuľke 3.11 označené modrou farbou). Zatiaľ čo NP12 predstavuje tri sulfátové skupiny na ligand, ligand NP13 má iba dve s inak identickou štruktúrou. Tabuľka 3.11: Hodnoty IC50 pre sulfatované Au-NP. Priemer jadra NP Au je približne 6 nm. Hodnoty označené zelenou farbou boli určené pre inú dávku NP, boli však pre túto tabuľku matematicky upravené. Názov inhibítora IC50 L-selektín IC50 P-selektín IC50 E-selektín S3Na S 3Na Au S 9 N H NP pm 460 pm N.I. S3Na S 3Na Au S 9 N H NP pm 300 pm N.I. S 3 Na S3Na Au S 9 N H S3Na NP7 80 pm 130 pm N.I. 129
132 3 Výsledky a diskusia Tabuľka 3.13: Hodnoty IC50 sulfatovaných Au-NP s ligandmi, ktoré nesú hydrofóbne zložky. Priemer jadra Au-NP je približne 6 nm. Označenie inhibítora IC50 L- selektín IC50 P- selektín IC50 E- selektín S 3Na S 3Na Au S 9 N H NP pm 130 pm N.I. S 3 Na NP pm 150 pm N.I. Au S 9 N H S 3Na S3Na Au S 9 N H S 3Na NP7 80 pm 130 pm N.I. Je zaujímavé, že MUDS koordinované Au koloidy (NP18) sú tiež schopné inhibovať väzbu L- a P-selektínu. Nevýhodou MUDS koordinovaných Au-NP je ich zlá agregačná stabilita pri hodnotách pH nižších ako 9. Roztoky MUDS koordinovaných Au-NP sa dajú vyrobiť iba vo veľmi nízkych koncentráciách, ale môžu sa skladovať iba krátkodobo. Pre tu uvedené experimenty bol pripravený 30 nmolárny roztok (na základe koncentrácie NP) a bol vyšetrený do 24 hodín. Hodnoty IC50 pre súradnicu MUDS. Au NP s priemerom jadra približne 6 nm sú uvedené v tabuľke 3.14. Pre porovnanie sa tu tiež stanovili hodnoty IC50 NP7 a MUD síranom koordinovaných Au NP (NP19) s priemerom jadra približne 6 nm. Syntézy NP18 a NP19 už boli predstavené v časti (schéma výmeny ligandov, pozri obrázok 3.29). 132
134 3 Výsledky a diskusia NP s citrátom koordinovaným Au NP, ktoré tiež prezentujú karboxylátové funkcie na svojom povrchu. Zatiaľ čo MUDS koordinujú. Au-NP pre hodnoty IC50 pre L- a P-selektín v pikomolárnom rozmedzí nemohlo inhibovať väzbu selektínu v prítomnosti citrátovej skupiny. Možno pozorovať Au NP. Okrem negatívne nabitej podštruktúry musia byť preto splnené ďalšie požiadavky, aby sa dosiahla dobrá väzobná afinita. Na viazanie nestačí ponúknuť záporne nabitú časticu v určitom rozmedzí veľkostí. Väzbové správanie citrátového koordínu. Au-NP už naznačuje, že namerané výsledky nie sú spôsobené nešpecifickými interakciami medzi selektínom a nanočasticami. Obrázok 3.71 zobrazuje dva ďalšie príklady NP, ktoré nevykazovali žiadny inhibičný účinok v teste kompetitívnej väzby. a) b) Au N N Au S H Obrázok 3.71: a) súradnica DMAP. Au-NP a b) Pol1-súradnica. Au NP 9.
21 Aj pri vysokých koncentráciách NP sa po inkubácii neviazaných Au NP s L-selektínom získala relatívna väzba 100%, a teda žiadna inhibícia. Výsledkom je, že medzi selektínom a NP nie sú merateľné nešpecifické interakcie. V súhrne boli hodnoty IC50 v pikomolárnom rozmedzí získané pre všetky tu skúmané polysulfátované NP, bez ohľadu na štruktúru. Štruktúra ligandu, a najmä priestorové usporiadanie skupín, ktoré sú k dispozícii pre väzbu na selektín, mali silný vplyv na väzobné vlastnosti NP. S komplexnejšími štruktúrami možno tiež získať selektívne väzobné správanie k L- a P-selektínu. P selektivita sa vyskytla najmä u ligandov, ktoré boli ľahko tvarovateľné a neboli stericky náročné. Jednoduché štruktúry inhibovali oba selektíny s podobnými hodnotami IC50. Spoľahlivá predpoveď 9 Polymér Pol1 syntetizovala Marie Weinhardt. 134