Príprava vzoriek lariev Drosophila pre plynovú chromatografiu-hmotnostnú spektrometriu (GC-MS)

Zhrnutie

Tento protokol popisuje, ako pripraviť larvy Drosophila pre metabolomickú analýzu založenú na GC-MS.

Abstrakt

Úvod

Ovocná muška Drosophila melanogaster sa ukázala ako ideálny systém na štúdium molekulárnych mechanizmov, ktoré regulujú stredný metabolizmus. Nielenže je väčšina metabolických ciest konzervovaných medzi ľuďmi a Drosophilou, ale dôležité sú aj senzory živín a regulátory rastu, ako napríklad inzulín, Tor a Myc, ktoré sú aktívne v muške 1, 2. Drosophila sa tak používa na výskum metabolických základov ľudských chorôb, cukrovky a obezity až po neurodegeneráciu a rakovinu. V tejto súvislosti poskytuje vývoj lariev Drosophila ideálne nastavenie pre stupeň metabolizmu známy ako aeróbna glykolýza alebo Warburgov efekt. Rovnako ako mnoho nádorov generuje aeróbnu glykolýzu biomasy zo sacharidov, urobte to tak, že aktivujete aeróbnu glykolýzu lariev Drosophila larvy, aby ste podporili vývojový rast 3, 4, 5. Tieto podobnosti medzi metabolizmom lariev a nádorov ustanovujú Drosophilu ako model pre pochopenie regulácie aeróbnej glykolýzy in vivo.

Napriek tomu, že sa muška stala populárnym modelom metabolizmu, väčšina štúdií Drosophila sa spolieha na metódy určené na meranie jednotlivých metabolitov 3, ako je trehalóza, triglyceridy alebo ATP. Pretože na meranie každého metabolitu je potrebný osobitný protokol, sú štúdie založené na testoch náročné na pracovnú silu, drahé a zaujaté voči týmto zlúčeninám, čo je možné merať pomocou komerčných súprav. Riešenie týchto obmedzení vyplynulo z oblasti metabolomiky, ktorá poskytuje efektívnejšie a nestrannejšie prostriedky metabolizmu Drosophila. Na rozdiel od štúdie založenej na analýze môže jedna metabolomická analýza súčasne merať stovky metabolitov s malými molekulami a poskytnúť komplexné pochopenie metabolického stavu organizmu 6, 7. Táto technika významne rozšírila metabolické štúdie Drosophila a predstavuje budúcnosť tohto objavujúceho sa poľa 8 .

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

2. Odber vzoriek lariev

30 sekúnd. Počas tejto doby larvy klesnú na dno skúmavky, ale kvasinky zostanú v suspenzii. Akonáhle všetky larvy vytvoria voľnú peletu, odstráňte roztok NaCl pomocou 1 ml pipety.

Opakujte 2,4 a 2,5 kroku dvakrát, alebo kým nie je číry posledný premývací roztok.
Poznámka: Ak zhromaždená vzorka obsahuje nadmerné množstvo kvasiniek, môžu byť potrebné ďalšie premývacie kroky.

Centrifugujte vzorky pri 2 000 x g počas 1 minúty pri 4 ° C.

Zvyšok roztoku odstráňte pomocou pipety s objemom 200 µL.

Okamžite zmrazte vzorku v tekutom dusíku.
Poznámka: V tomto okamihu je možné protokol pozastaviť. Vzorky sa môžu skladovať až 3 mesiace pri -80 ° C

3. Preneste vzorky do guľôčkových skúmaviek

16 h na dokončenie).
Poznámka: V prípade potreby je možné protokol v tomto okamihu pozastaviť. Vysušená vzorka sa môže skladovať pri -80 ° C

(5) chemická derivatizácia

Poznámka: Vo väčšine prípadov používateľ vykoná tento krok pomocou základného zariadenia hmotnostnej spektroskopie. Tento protokol je určený na použitie s 30 m stĺpmi GC s 5 m ochranným stĺpcom.

Náhodne objednajte vzorku.
Pripravte GC-MS.
1. Nastavte prietok héliového nosného plynu na 1 ml/min.
2. Nastavte teplotu na výstupe na 250 ° C.
3. Naprogramujte GC tak, aby spustil nasledujúci teplotný gradient:
  1. Počiatočná teplota 95 ° C s vplyvom 1 min.
  2. Zvyšujte teplotu na 110 ° C rýchlosťou 40 ° C/min na 2 minúty.
  3. Zvýšte rampu na 250 ° C až na 5 ° C/min.
  4. Zvyšujte konečné zastavenie o 4 minúty rýchlosťou 25 ° C/min na 330 ° C.
4. Nastavte oneskorenie rozpúšťadla na 3,5 minúty
  Poznámka: Čas je možné meniť podľa systému GC-MS. Tento krok má zabrániť MSTFA a MOX v poškodení detektora.
Nastreknite 1 ul derivatizovanej vzorky do GC-MS (deliaci pomer 10: 1).
Poznámka: Vstreknite 2 µL vzorky, ak je intenzita píkov príliš nízka. Poradie injekcií vzoriek by malo byť náhodné.
Hmotnostný spektrometer pracujte v režime úplného skenovania v hmotnostnom rozsahu 50 - 500 m/z.

Analýza metabolomických údajov využíva buď cielený alebo necielený prístup. Cielená analýza sa zameriava na meranie množstva definovaného súboru metabolitov, ako sú: B. merania laktátu, ktoré popisujeme nižšie. Naopak, necielená analýza využíva nezaujatý prístup na identifikáciu metabolických funkcií, ktoré sa medzi týmito dvoma súbormi vzoriek významne menia.
Poznámka: Naše laboratórium primárne využíva na analýzu dát bezplatné programy MetAlign 17 a MetaboAnalyst 18, 19. Pretože adekvátny popis krokov kontroly kvality, normalizácie a spracovania údajov presahuje rámec tohto rukopisu, odkazujeme používateľa na podrobnejšie protokoly venované spracovaniu údajov 20, 21, 22. Okrem toho vývojový diagram popisujúci kroky tejto analýzy možno nájsť na inom mieste 8.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Reprezentatívne výsledky

Laktátdehydrogenázové (dLDH) mutanty, ktorým chýba dLDH aktivita 4 a geneticky zodpovedajúce kontroly, sa zhromaždili ako larvy v polovici L2 a spracovali sa podľa protokolu opísaného vyššie. V porovnaní s kontrolami vykazujú mutantné larvy významné zmeny v laktáte, pyruváte a L-2-hydroxyglutaráte-4. Spektrá sa získavali na systéme MS Agilent GC6890-5973i. Príklad na generovanie spektier GC-MS pomocou nášho protokolu je uvedený na obrázku 1zobrazené. Existuje veľa viditeľných znakov a pozoruhodný vrchol trehalózy, ktorý je zvyčajne najväčším vrcholom vo vzorke lariev a je zvyčajne presýtený (obrázok 1A).B.). Jednotlivé spektrum negatívnej kontrolnej vzorky je znázornené na obrázku 1zobrazené. Aj keď vo vzorke negatívnej kontroly stále existujú niektoré viditeľné vrcholy, intenzita a počet vrcholov klesá v porovnaní s experimentálnymi vzorkami uvedenými v Obr. 1A, B.. Tieto vrcholy sú v podstate výsledkom krvácania z kolóny, vnútorného štandardu (kyselina jantárová-kyselina d4), FAME a kontaminujúcich mastných kyselín. Príprava neúspešnej vzorky generuje spektrum podobné spektru na obrázku 1zobrazené.

Spektrá boli vopred spracované pomocou MetAlign 17 a údaje boli normalizované pomocou vnútorného štandardu a hmotnosti peliet. Údaje sa potom predložili spoločnosti MetaboAnalyst 18, 19 na štatistickú analýzu. Hlavná zložka (analýza, PCA) jasne ukazuje, že tieto dve skupiny sa navzájom od seba oddeľujú, v žiadnej skupine nie sú žiadne mimoriadne hodnoty (obrázok 2A).). Ďalšia analýza ukazuje významné zmeny v metabolite známe zo straty dLDH (obr. 2b) 4 ovplyvnené.

ilustrácia 1 : Reprezentatívne spektrá GC-MS od Drosophila Výťažok z lariev. (Z) Typické spektrá extraktov lariev stredného L2 z divokého typu (WT) a dLDH mutantov (KO). (C) reprezentatívne spektrum GC-MS generované z negatívnej kontroly (NC). Väčšina vrcholov v tomto rozmedzí je od vnútorných, celebrít a mastných. (D-F) V porovnaní so vzorkami WT vykazovali vzorky KO zvýšené hladiny (D) Pyruvát a laktát (E) a (F) Znížil sa 2-hydroxyglutarát (2-HG). Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Obrázok 2 : Štatistická analýza ukazuje rôzne metabolické profily medzi divokým typom (WT) a dLDH Larvy vyradenia (KO). (A) Graf skóre PCA. (B) -Metabolity, ktoré mutovali zmeny v dLDH. Všetky dátové body sa čerpajú na základe strednej hodnoty riadiaceho prvku WT, ktorá bola nastavená na ľubovoľnú hodnotu 100. Pred analýzou boli dáta normalizované na vnútornú kyselinu jantárovú d4 štandardné a obsahovali pelety lariev. Údaje ako priemer ± jedna štandardná odchýlka. p Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Diskusia

Metabolomics ponúka jedinečnú príležitosť na meranie metabolických reakcií na zloženie medziproduktu. Vďaka citlivosti tejto technológie sú však údaje zraniteľné voči genetickému pozadiu, vývojovým faktorom a širokej škále environmentálnych tlakov vrátane teploty, vlhkosti, hustoty obyvateľstva a dostupnosti živín. Preto vysoko kvalitná a reprodukovateľná metabolomická analýza vyžaduje, aby sa vzorky zbierali za veľmi kontrolovaných podmienok. Zatiaľ čo niektoré príspevky v tomto bode zdôrazňujú 3, 8, 23, ponúkame tu podrobnú metódu odberu lariev navrhnutú tak, aby sa zabezpečila reprodukovateľnosť.

Najbežnejšia príčina variability v metabolomickej analýze je zlyhanie dojčenia alebo zastavenia metabolických reakcií po zachytení vzorky. V tomto ohľade sa metabolizmus zastaví, keď je zmrazený v kvapalnom dusíku, a metabolické enzýmy sú zničené, keď je vzorka homogenizovaná pri -20 ° C metanolu. Za predpokladu, že používateľ venuje osobitnú pozornosť udržiavaniu vzorky pred extrakciou metanolu, je cieľom nášho protokolu zabezpečiť, aby metabolomické údaje generované týmto postupom predstavovali presný prehľad metabolizmu lariev. Ak by používateľ zaznamenal neprijateľnú variabilitu údajov, mal by prehodnotiť protokol o odbere a extrakcii metabolitov a venovať osobitnú pozornosť zabezpečeniu (1) rýchleho zastavenia metabolizmu (kroky 2.9 - 4.2) a (2) účinnosti vzorky. homogenizovaný v 90% metanole (krok 4.4). Z tohto hľadiska veľa perličkových mlynov neposkytuje dostatok energie na homogenizáciu vzoriek v stanovenom čase a používateľovi odporúčame použiť prístroj, ktorý bol použitý v predchádzajúcich štúdiách 8.

A nakoniec, tu uvedené metódy sú mocným nástrojom metabolizmu Drosophila. Tento protokol však nie je špecifický pre Drosophila a dá sa s niekoľkými modifikáciami použiť na štúdie metabolického vedenia u každého malého bezstavovca. Bez ohľadu na druh je možné túto jednoduchú metódu použiť na relatívnu kvantifikáciu takmer všetkých aminokyselín, medziproduktov v glykolýze a TCA cykle, ako aj mnohých ďalších malých polárnych molekúl. Spolu s neporovnateľnými genetickými nástrojmi, ktoré má komunita Drosophila k dispozícii, tento typ metabolomickej analýzy stavia mušku do popredia metabolického výskumu v dohľadnej budúcnosti.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.