Protokol imunokomagnetickej separácie kmeňových buniek odvodených od tuku Sca1high odvodených z tukového tkaniva (ASC)

Úvod

V oblasti obezity a cukrovky zohrávajú fibróza a zápal tkanív rozhodujúcu úlohu pri vývoji a udržiavaní cukrovky 2. typu. Nedávno Tokunaga a kol. ukázali, že z inguinálnych izolovaných vysokých buniek Sca1 (alebo subkutánne, SQ) a perigonadálnych (alebo viscerálnych, VIS) 10 rôznych génov a ECM remodelácie in vitro C57BL6/J tukové zásoby. MMP14 (MT1-MMP), prototypový člen rodiny matricových membrán - metaloproteináz (MMP), sprostredkováva vývoj bieleho tukového tkaniva (WAT) prostredníctvom svojej kolagenolytickej aktivity 1.

Príklady experimentov, ktoré je možné uskutočniť s bunkami nasledujúcim protokolom, zahŕňajú trojrozmernú kultúru, diferenciačné štúdie, testy degradácie kolagénu a sekvenovanie RNA 10,11 izolované a obohatené. Testy degradácie by sa mali uskutočňovať s kyselinou extrahovaným kolagénom, aby sa zabezpečila ochrana telopeptidu 11,12. Nasledujúci protokol demonštruje metódy izolácie vaskulárnej strómy primárnych buniek z rôznych tukových ložísk a ich obohatenie na progenitorové bunky adipocytov pomocou imunomagnetickej bunkovej separácie. Platnosť triedenia buniek je možné hodnotiť prietokovou cytometriou a použitím myší Sca1-GFP - myší, ktoré exprimujú GFP v bunkách Sca1 +, riadené promótorom Sca1 13.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

Etické vyhlásenie: Výbor pre používanie a starostlivosť o zvieratá na University of Michigan (UCUCA) schválil všetky metódy a protokoly v súlade s príručkou pre starostlivosť a použitie laboratórnych zvierat (Institute for Laboratory Animal Research, National Research Council). Myši sú umiestnené vo viváriu University of Michigan, je im poskytnutý voľný prístup k potrave a vode a sú udržiavané v 12 hodinovom cykle svetlo/tma.

2. Izolácia podkožných (SQ) tukových vankúšikov

  1. Eutanázujte myš predávkovaním izofluránom a pneumotoraxom.
  2. Jemne postriekajte myš 70% etanolom a položte ju na chrbát. Pripichnite labky k penovej doske pomocou 22 G ihiel.
  3. Na pokožke brucha urobte malý rez. Držte špičku rezu kliešťami, zoberte nožnice a pred oddelením pobrušnice oddeľte kožu.
  4. Akonáhle je pokožka oddelená od pobrušnice od brucha k hrudníku, koža sa zrkadlí od pobrušnice smerom k hlave prostredníctvom bočných rezov v koži pozdĺž boku tela.
  5. Zrkadlite zostávajúcu kožu v slabinách, pričom tuk držte od tela, a ihlami 22 G ho zovrite na doštičke.
  6. Prepnite na jemné nožnice a pinzetu. Chyťte kliešťový tuk podkožným tukom pomocou pinzety na začiatku v blízkosti pobrušnice a odstráňte ho medzi kožu a trieslový tuk smerom k slabinám a zabráňte kontaminácii pokožky SQ.
  7. Vložte izolovaný inguinálny tukový vankúš do určenej 60 mm misky.

3. Izolácia tukových vankúšikov Visceral (VIS)

  1. Podobným spôsobom ako v kroku 2.5. Rozrežte pobrušnicu, aby sa odhalil viscerálny tuk.
  2. Posuňte črevo smerom k hrudníku.
  3. Chyťte tukovú vložku VIS na distálnom konci a jemne ju vytiahnite nahor. Rozrežte tukovú podložku VIS a opatrne vylúčte tkanivo nadsemenníka (alebo maternice, ak sa používajú samice myší).
  4. Vložte do zásobníka štítkov a zopakujte krok 3.3 pre zvyšnú podložku VIS.

4. Kolagenáza trávenie tukových usadenín

6. Overenie imunomagnetickej separácie vysokých ACS Sca1 pomocou prietokovej cytometrie

  1. Bunky dvakrát opláchnite HBSS (-Ca, -Mg) a bunky disociujte pomocou 0,05% trypsínu.
  2. Centrifugujte bunky pri 300 xg po dobu 5 minút. Bunky resuspendujte v 1 ml kultivačného média a spočítajte počítaciu komoru.
  3. Získa sa> 106 buniek v 1 ml kultivačného média a centrifuguje sa pri 300 g po dobu 5 minút.
  4. Odstráňte supernatant a zopakujte krok 6.3 ešte dvakrát.
  5. Bunky s 1 ml 2% kozieho séra + 2% BSA a blokované 30 minút pri RT.
  6. Bunky sa centrifugujú pri 300 xg počas 5 minút.
  7. Odstráňte zablokovaný roztok.
  8. Pridajte potkanie IgG2a Alexa Fluor 647 (0,25 ug, 1: 400) alebo anti-Sca1 Alexa Fluor 647 (0,25 ug, 1: 400), v 100 ug. 1 PBS s 2% kozím sérom a 2% BSA + PBS pri 4 ° C počas 30 minút v tme.
  9. K bunkám sa pridá 1 ml studeného PBS. Odstreďujte 300 xg po dobu 5 minút pri 4 ° C.
  10. Odstráňte supernatant a opakujte krok 6.9 ešte dvakrát.
  11. Bunky v 1 ml PBS. Suspenzie buniek sa prevedú cez 100 ul. m Bunkové sito ako príprava na prietokovú cytometrickú analýzu.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Reprezentatívne výsledky

Hromadenie vysokých ASCS Sca1 z rôznych tukových vankúšikov.

Vaskulárne stromálne bunky izolované z SQ tuku vykazujú predĺžený tvar buniek podobný fibroblastom bez ohľadu na úroveň expresie Sca1. (Obrázok 1A). Na druhej strane bunky VIS (odvodené od EWAT) Sca1 vysoké a Sca1 nízke vykazujú výrazné rozdiely v ich tvare buniek. Rovnako ako vysoké bunky Sca1 SQ (odvodené od iWAT), vysoké bunky VIS (odvodené od EWAT) Sca1 vykazujú predĺžený tvar buniek podobný fibroblastom, zatiaľ čo nízke bunky VIS Sca1 vykazujú tvar epitelioidu. SCA1 vysoké bunky izolované z SCA1-GFP myší sú ľahko identifikované ako GFP-pozitívne bunky v tkanivovej kultúre (1B) identifikované. Keď sa tieto bunky hodnotili pomocou prietoku cytometriou, potvrdilo sa, že väčšina GFP pozitívnych buniek exprimuje proteíny Sca1 na povrchu bunky, čo sa dokázalo protilátkou Ti-Sca1. (1C). Vysoké bunky Sca1 pochádzajúce z inguinálnych tukových vankúšikov udržiavajú kapacitu adipocytov - diferenciácia sa zvyšuje, zatiaľ čo bunky Sca1 vysoké bunky odvodené od EWAT sa dajú ťažšie odlíšiť od konvenčných 10 adipogénnych zmesí v adipocytoch.

Expresia génov závislých na tukoch od Sca1 High ASCS (Obrázok 2).

Analýzy transkriptómu v celom genóme s použitím sekvenovania RNA ukázali obohatenie génov v spojení s proteínmi a modifikátormi extracelulárnej matrice (GO: 0,031,012, GO: 0005578) v týchto vysokých AS1 ASCS 10 Expresia kolagenolytických MMP (MMP-2, MMP8, MMP13, MMP14) medzi Sca1 odvodenými z iWAT a EWAT na demonštráciu vysokých ASCS. Keď sa použili fluorescenčné značené kolagénové gély typu I, aby sme mohli vyhodnotiť pericelulárnu degradačnú aktivitu, pozorovali sme signifikantne zvýšenú aktivitu remodelácie kolagénu sprostredkovanú VIS Sca1 vysokým ASCS 10.

odvodených
Obrázok 1: Imunomagnetická separácia vysokej myšej Sca1 ASCS z rôznych tukových zásob (A) Sca1 high a Sca1 low ASCS izolované od SQ (iWAT) a VIS (EWAT). Mierka = 100 p m. (B) Sca1-GFP bunky izolované iWAT z Sca-GFP myší. Mierka = 100 p m. (C) Expresia Scal na povrchu bunky v Sca1-GFP-pozitívnych bunkách sa hodnotila pomocou prietokovej cytometrie. (Vľavo) kontrolné potkanie IgG (pravé) protilátky proti Sca1. Os X, intenzita GFP. Os Y, Alexa-Fluor 647. Panel A predtým uvedený v Tokunaga, M. a kol., (2014) .ig1large.jpg "target =" _ blank "> Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

odvodených
Obrázok 2:. Expresia kolagenolytických MMP, TIMP a kolagénov závislá na tukoch (A) Diferenciálna génová expresia ECM a modifikátorov ECM v Sca1 vysokej ASCS izolovanej z rôznych tukových ložísk. (B) zvýšená aktivita degradácie kolagénu VIS (odvodené z EWAT) Sca1 vysoké ASCS. Rozklad kolagénu sa ukazuje ako zmiznutie fluorescenčných signálov (šípky a hroty šípov). Vložený obraz je zväčšený obraz rozloženia zameraného kolagénu sprostredkovaný jednou bunkou SQ ASCS. Bunky sa kultivovali 72 hodín. Dáta uvedené skôr v Tokunaga, M. a kol., (2014). Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Diskusia

Tu ukážeme izoláciu a imunomagnetickú bunkovú separáciu myších ASCS z rôznych tukových vankúšikov a ich použitie na experimenty in vitro. Predložená metóda je účinná na rýchlu izoláciu veľkého počtu Sca1-pozitívnych ASCS, čo je výhodné oproti technicky zložitej a nákladnej izolácii ASCS 9,14 sprostredkovanej FACS. Na rozdiel od FACS imunomagnetická bunková separácia neumožňuje použitie viacerých antigénov na identifikáciu cieľovej bunkovej populácie. Ak je však povrchový antigén dobre charakterizovaný, použitie imunomagnetickej separácie zvyšuje počet buniek bez toho, aby sa spoliehalo na použitie zariadení FACS 15, ktoré stále nie sú ľahko dostupné v malých ústavoch bez základných zariadení na analýzu mnohých biologických výskumníkov. .

Zatiaľ čo Sca1 sa nenachádza v ľudskom genóme, identifikácia a validácia alternatívnych povrchových antigénov na kmeňových bunkách ľudského tukového tkaniva závislých od tukového depotu, v spojení s touto technikou separácie buniek, nám môže pomôcť definovať biológiu kmeňových buniek ľudského tukového tkaniva.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Zverejnenie

Autori nemajú čo prezradiť.

Poďakovanie

Túto prácu podporuje NIH DK095137 (THC). Ďakujeme súčasným aj bývalým členom laboratória, ktorí prispeli k vývoju a zdokonaleniu opísaných postupov.