Regulácia aktínového cytoskeletu v pankreatických acínových bunkách tyrozínkinázou Áno - PDF

Univerzita v Ulme, Katedra interného lekárstva I Vedúci prof. G. Adler Regulácia aktínového cytoskeletu v pankreatických acínových bunkách tyrozínkinázou Áno Dizertačná práca na získanie doktorandského titulu v odbore biológia človeka (Dr. biol. Hum.) Lekárskej fakulty Univerzity v Ulme, predložil Grit Lynch z Frankenbergu 2002

regulácia

Poverený dekan: prof. Klotz 1. reportér: PD Dr. Lutz 2. reportér: Dr. Deň doktorátu: 20. decembra 2002

Venovanie mojim rodičom, ktorí vždy podporovali moje sny

Obsah 1 OBSAH OBSAH. 1 SKRATKY. 3 1. ÚVOD. 5 2. CIEĽ. 19 3. MATERIÁL A METÓDY. 20 3.1. Materiál a zvieratá. 20 3.1.1. PROTILÁTKA. 20 3.1.2. CHEMIKÁLIE. 21 3.1.3. ZVIERATÁ. 21 3.2. Metódy. 22 3.2.1. IZOLÁCIA AZINI Z RATOVEJ PANKREY. 22 3.2.2. ŠTÚDIE O AMYLÁZOVEJ SEKRÉCII NA ČERSTVE IZOLOVANÝCH RAT AZINI. 23 3.2.3. IMUNITNÝ FLUORESCENTNÝ STAIN. 23 3.2.4. VÝROBA PROTEÍNOVÝCH VÝŤAŽKOV. 24 3.2.5. STANOVENIE KONCENTRÁCIE PROTEÍNOV. 25 3.2.6. SUBCELULÁRNA FRAKCIA. 26 3.2.7. IMUNPRECIPITÁCIA. 27 3.2.7. GELOVÁ ELEKTROFORETICKÁ ANALÝZA PROTEÍNOV NA STRANE SDS. 28 3.2.8. ZÁPADNÉ BLOTOVANIE. 29 3.2.9. DETEKCIA PROTEÍNOV S PROTILÁTKAMI. 29 3.2.10. INDICKÉ TLAČENIE. 30 3.2.11. KINASE AKTIVITA ÁNO. 31 3.2.12. DENZITOMETRICKÉ HODNOTENIE IMUNOBLOTOV. 32 3.2.13. IZOLÁCIA RNA Z AZINI. 32 3.2.14. KONTROLA ČISTOTY A KVALITY RNA. 32 3.2.15. HYBRIDIZÁCIA GÉNOVÝCH POLÍ. 34 4. VÝSLEDKY. 37

Obsah 2 4.1. Regulácia na úrovni bielkovín. 4.1.1. VYJADRENIE BIELKOVÍN KINÁCH SRC. 4.1.2. TYROZÍNOVÁ FOSFORALÁCIA OD ÁNO PO STIMULÁCIU CCK. 38 4.1.3. KINOVÁ ČINNOSŤ ÁNO. 41 4.1.4. LOKALIZÁCIA A REDISTRIBÚCIA ÁNO. 44 4.1.5. KORELÁCIA MEDZI ROZDELENÍM AKTÍV A ANO AKTIVITOU. 46 4.1.6. SEKRETA Z IZOLOVANÝCH AZINI. 49 4.1.7. PROTEÍNY PRIDRUŽENÉ ÁNO. 51 4.2. Génová expresia. 53 4.2.1. TESTOVANIE KONCENTRÁCIÍ NA IZOLÁCIU RNA. 54 4.2.2. GENOVÝ VÝRAZ PO STIMULÁCII S CCK. 55 5. DISKUSIA. 60 5.1. Regulácia bielkovín. 60 5.2. Diferenciálna génová expresia. 66 6. ZHRNUTIE. 69 7. ZOZNAM LITERATÚRY. 71 PRÍLOHA. 83

Skratky 3 SKRATKY Obr. Obrázok Voda Dvojitá destilovaná voda BSA Hovädzie sérum Albumín CCK Cholecystokinín CCK-R CCK Receptor ECM Extracellular Matrix a kol. A ďalší Exp Experiment FAK Fokálna adhézia Kináza g gramov IB Imunoblot IF Imunofluorescencia IgG Imunoglobulín G IP Imunoprecipitácia + Svetlo (oba reťazce IgG) HRP chrenová peroxidáza (chrenová peroxidáza) kda kilodalton kg kilogram M molárny min. Minúta mk monoklonálny ml mililiter µg mikrogramu N normálna nm nanometr nm nanomolárny PBS fosfátom pufrovaný soľný roztok PMSF fenylmetylénsulfonylfluorid pk polyklonálny

Skratky 16:00 pikomolárny PVDF polyvinylidéndifluorid Pyk2 na prolíny bohatá tyrozínkináza 2 RT izbová teplota SDS dodecylsulfát sodný SEM štandardná chyba SH Src homológia TBS Tris-pufrovaný soľný roztok Tyr tyrozín napr. napríklad

1. Úvod 12 Adherens junction (Ohkubo et al. 1999). p120ctn nie je priamo zapojený do interakcie proteín-proteín s aktínovým vláknovým systémom, pretože sa nemôže viazať na α-katenín. Jedným z možných regulačných mechanizmov proteínov zonula adherens je fosforylácia tyrozínu, pretože β- a y-katenín, ako aj p120ctn, môžu byť tyrozín fosforylované stimuláciou rastovými faktormi (Hazan et al. 1998; Rosato et al. 1998). P120ctn stabilizuje adhéziu medzi bunkami väzbou na E-kadherín (Yap a kol. 1998), čo je inhibované hyperfosforyláciou p120ctn počas mitózy (Hazan a kol. 1998). Tyrozínová fosforylácia katenín môže hrať kľúčovú úlohu v stabilite alebo nestabilite zonula adherens, a tým v ukotvení systému aktínových vlákien s plazmatickou membránou (Behrens et al. 1993). V štúdiách s izolovanými acínmi sa tiež pozorovala zmena stupňa fosforylácie p120ctn po stimulácii supramaximálnymi sekrečnými koncentráciami CCK (Leser et al. 2000).

1. Úvod 14 Predmetný FAK a paxilín. Všetky 3 proteíny boli opísané ako substráty Src kináz v iných bunkových systémoch (Calautti a kol. 1998); (Schlaepfer a kol. 1999; Shen a kol. 2001). Rodina kináz Src obsahuje 9 proteínov s výraznou štrukturálnou homológiou. Väčšina kináz rodiny Src je exprimovaná iba v krvotvorných bunkách, kde sú často nadbytočné, čo bolo preukázané v knock-out modeloch (Smith et al. 2001). Na druhej strane sú Src kinázy Yes, Lyn, Fyn a Src všadeprítomné a zdá sa, že preberajú rôzne úlohy (Thomas et al. 1995). Src kinázy sú spočiatku lokalizované v cytoplazme a ako aktívne enzýmy sa viažu takmer výlučne na bunkové membrány. Na základe sekvenčných homológií je možné diferencovať celkovo šesť funkčne relevantných domén s rôznymi úlohami (obr. 3). (Brown a kol. 1996)

1. Úvod 17 zloženého proteínu a nemôže byť fosforylovaný (Gonfloni et al. 2000). Viazanie substrátov na doménu SH2 je tiež ťažké. Existuje niekoľko možností aktivácie Src kináz: Defosforylácia Tyr 527 fosfatázovou kompetitívnou väzbou vysoko afinitného substrátu na doménu SH2 alebo SH3, čím je fosforylovaný Tyr 527 vytesnený alosterický aktivátor alebo modifikácia proteínu (napr. Fosforylácia serínu/treonínu), čo je uzavretá Konformácia sa destabilizovala. Vo všetkých prípadoch sa proteín rozvinie a je umožnená autofosforylácia kinázovej domény (obr. 4). To aktivuje kinázu. Csk je opísaný ako negatívny regulačný proteín, ktorý je zodpovedný za fosforyláciu Tyr 527 (Brown et al. 1996).

1. Úvod 18 PTyr 527 Tyr 527 neaktívny aktívny Obr. 4: Regulácia aktivity Src kináz. V neaktívnej forme (vľavo) je proteín vo vysoko zloženom stave. V aktívnej forme sa doména SH3 oddeľuje od závitnice bohatej na prolín a doména SH2 sa už neviaže na chvostovú oblasť (teraz s nefosforylovaným tyrozínovým zvyškom). Aktívna strana viaže ATP (červená), ktorá drží fosfátovú skupinu pripravenú na aktiváciu. Prvou reakciou je fosforylácia tyrozínového zvyšku hneď vedľa väzbového miesta pre ATP (autofosforylácia). Keď je tento tyrozín fosforylovaný, enzým sa maximálne aktivuje. (po Godsell 2001)

3. Materiál a metódy 20 3. MATERIÁL A METÓDY 3.1. MATERIÁL A ZVIERATÁ 3.1.1. Protilátky V nasledujúcej tabuľke (tabuľka 2) sú uvedené všetky použité primárne protilátky/antiséra a ich zdroje. Označenie Druh Výrobca IB IP IF Áno Myš, mk Transdukcia 1: 5000 Pyk2 myš, mk Transdukcia 1: 1000 Pyk2 králik, Biomol, pk Hamburg Fosfotyrozínová (PY20) myš, mk Transdukcia 1: 2500 Src myš, mk UBI 1: 200 Fyn králik, pk UBI 1: 500 Lyn Hase, pk Santa Cruz 1: 500 FAK myš, mk Transdukcia 1: 1000 P120ctn myš, mk Transdukcia 1: 1000 3 5 ug, pre 350 750 ug proteínu 5 ug pre 750 ug proteínu 5 ug pre 650 ug Proteín 1: 1 000 1: 200 Tabuľka 2: Primárne protilátky Všetky sekundárne protilátky spojené s peroxidázou boli získané od spoločnosti Pierce. Na imunofluorescenčné farbenie sa Alexa 488 spojené sekundárne protilátky získali od Molecular Probes (Eugene, USA) a Cy3 spojené sekundárne protilátky od Dianova (Hamburg).

3. Materiál a metódy 21 3.1.2. Chemické označenie Aminokyseliny (nie nevyhnutné, MEM 100x) CCK-8, sulfátované (CCK 25-32) kolagenáza (CLSPA) L-glutamín Oregon Zelený faloidínový hovädzí sérový albumín (BSA) Sójový inhibítor trypsínu Výrobca Life Technologies, Karlsruhe Bachem, Bubendorf, Švajčiarsko Worthington, Cell Systems, Hamburg Life Technologies, Karlsruhe Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA Fluka, Buchs Boehringer, Mannheim Tabuľka 3: Látky Všetky ostatné chemikálie boli, pokiaľ nie je v texte uvedené inak, na str. A. alebo ultra čistá kvalita od výrobcov Fluka (Buchs), Merck (Frankfurt), Roth (Karlsruhe) a Sigma (Deisenhofen). 3.1.3. Zvieratá Testovanými zvieratami boli samce potkanov Wistar inbredného kmeňa WAG/RijCrl (Charles River, Sulzfeld). Chovali sa v skupinách s maximálne 3 potkanmi na klietku za kontrolovaných podmienok svetlo-tma, s 12-hodinovou fázou tmy medzi 19. a 7. hodinou. Izby boli klimatizované (teplota miestnosti 21 ° C, vlhkosť 55%). Zvieratá boli kŕmené chovnou a chovnou stravou Altromin ad libitum. V pokusoch sme použili potkany s hmotnosťou 100 - 200 g, ktoré sa nechali hladovať cez noc.

3. Materiál a metódy 24 blokované v PBS. Primárne protilátky (v PBS) sa inkubovali buď 1 hodinu pri teplote miestnosti alebo cez noc pri 4 ° C. Sklíčka sa potom trikrát premyli PBS. Inkubácia so sekundárnou protilátkou spojenou s fluórchrómom alebo s 0,2 um faloloidínom konjugovaným s Oregon Green prebiehala dve hodiny v tme pri teplote miestnosti. Sklíčka sa potom trikrát premyli a potom sa acini vložili do Mowiolu (Calbiochem, Bad Soden) a naniesli sa na sklíčka. Analýza imunofluorescenčného farbenia sa uskutočňovala pomocou konfokálneho laserového skenovacieho mikroskopu (TCS 4D, Leica, Heidelberg). 3.2.4. Produkcia proteínových extraktov V závislosti od problému sa použili nasledujúce lyzačné pufre. Pufr na lýzu deoxycholát/tritón: Tris/HCl, pH 7,5 50 mm NaCl 150 mm EGTA 1 mm EDTA 0,4 mm Triton X-100 1% deoxycholát 1% (hmotn./obj.) Na orthovanadát 0,5 mm Na- Fluorid 5 mm sójový inhibítor trypsínu 1 mg/ml PMSF 1 mm aprotinín 1,4 ug/ml leupeptín 10 ug/ml Tento pufor sa použil na analýzu tyrozín-fosforylovaných proteínov a stanovenie aktivity kinázy.

3. Materiál a metódy 25 DTT/Triton X-100 lyzačný tlmivý roztok (podľa Antibody Array, Biocat, Heidelberg): Tris/HCl, pH 7,5 15 mm NaCl 120 mm KCl 25 mm EGTA 2 mm EDTA 2 mm DTT 0,1 mm Triton X-100 0,5% Na orthovanadát 0,5 mm Na fluorid 5 mm sójový inhibítor trypsínu 1 mg/ml PMSF 1 mm aprotinín 1,4 ug/ml leupeptín 10 ug/ml Tento pufor sa použil na koimunoprecipitáciu použité proteínové komplexy Yes-Pyk2. Príslušné stimulácie sa zastavili pridaním ľadovo chladného tlmivého roztoku KRH a potom sa bunky peletovali pri 500 x g. Supernatant sa potom odsal a acini sa každý resuspendoval v 200 400 ul lyzačného pufra a homogenizoval sa ultrazvukom po dobu 5 sekúnd. Následná inkubácia na ľade trvala 30 minút na izoláciu komplexov proteín-proteín a 10 minút na všetky ostatné izolácie. Nerozpustné látky sa peletovali centrifugáciou najmenej 20 minút pri 10 000 x g pri 4 ° C. 3.2.5. Stanovenie koncentrácie proteínu Obsah proteínov v extraktoch sa stanovil modifikovanou Bradfordovou metódou pomocou testu BioRad Protein Assay (BioRad, Mníchov) a kalibračnej linky BSA (0,7 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,3 mg/ml; 0, 1 mg/ml).

3. Materiál a metódy 28 3.2.7. Gélová elektroforetická analýza proteínov pomocou SDS-PAGE Použité tlmivé roztoky (podľa Lämmli 1970): 10 x SDS bežiaci tlmivý roztok Tris 25 mm glycín 191 mm SDS 10% (hmotn./obj.) Separačný gélový tlmivý roztok Tris, pH 8,8 1,5 M SDS 0,4 % Stohovací gélový pufor Tris, ph 6,8 0,5 M SDS 0,4% 4 x SDS vzorkový pufor Tris, ph 6,8 250 mm glycerol 40% SDS 10% 2-merkaptoetanol 20% brómfenol modrá 1 mg Systém diskontinuálnych SDS polyakrylamidová gélová elektroforéza použitá v modifikovanej forme podľa Lämmli 1970. Mini-Protean II (BioRad, Mníchov) slúžil ako prístroj na elektroforézu. Aplikovalo sa 20 ug celkového proteínu z lyzátov alebo supernatantu z imunoprecipitátov, ktoré boli predtým zmiešané so 4x SDS vzorkovým pufrom a tepelne denaturované (5 minút, 95 ° C). Elektroforéza prebiehala pri konštantnej sile prúdu 20 ma v stohovacom géli a 35 ma v separačnom géle.

3. Materiály a metódy 32 a kinázová reakcia sa uskutočňovala s koncentráciou ATP 10 mm pri 37 ° C po dobu jednej hodiny. Všetky ďalšie kroky boli spracované podľa pokynov. Absorpcia sa merala pri 405 nm (referenčná vlnová dĺžka 620 nm). 3.2.12. Denzitometrické hodnotenie imunoblotov Na denzitometrické porovnanie síl pásma boli exponované röntgenové filmy skenované pomocou skenera prechodu svetla (Sharp JX-330) a analyzované pomocou softvéru 1D od spoločnosti Phoretix (New Castle upon Thyne, Veľká Británia). 3.2.13. Izolácia RNA z acini Stimulácia izolovaných acini bola zastavená ľadovo chladným PBS bez RNAzy, centrifugovaná pri 1000 ot./min. Po dobu 5 minút a supernatant bol odstránený. RNA sa izolovala podľa protokolu Promega (SV Total RNA Isolation System, Promega, Mannheim). 3.2.14. Kontrola čistoty a kvality stanovenia koncentrácie RNA Izolovaná RNA sa zriedila 1: 100 vodou a absorpcia sa merala pri dvoch rôznych vlnových dĺžkach. Koncentrácia RNA bola vypočítaná z absorpcie pri 260 nm a čistota izolovanej RNA bola získaná z pomeru 260/280 nm. Výpočet koncentrácie: absorpcia 1 = 40 ug/ml

3. Materiál a metódy 34 mierne zmiešané. Vzorky sa vložili do gélu a separovali sa pri 50 V asi 1-2 hodiny. 3.2.15. Hybridizácia génových polí Prehybridizácia filtrov 0,5% SDS sa varilo a membrány (GF300 - GeneFilters Rat Microarrays Release 1, Res Gen, Invitrogen) sa inkubovali s týmto roztokom po dobu 10 minút pri izbovej teplote pred každou prehybridizáciou. 90 ul DNA spermií z lososa (ssdna) sa varilo 5 minút pri 95 ° C a krátko sa ochladilo na ľade. Potom sa ssdna a 120 ul trna pridali do 12 ml prehybridizačného pufra. Prehybridizácia sa uskutočňovala niekoľko hodín pri 42 ° C v hybridizačnej peci. Prehybridizačný pufer: formamid 50% SSC 6x Denhardt s 5x NaPO4 50 mm SDS 0,5% reverzná transkriptázová reakcia (RT), 25 μg RNA sa odparilo vždy na 11 μl kvapaliny v Speed ​​Vac. Pre RT bola použitá súprava Ambion Strip-EZTM RT (Ambion, Austin, TX). 25 ug RNA/11 ul 2 Ml Oligo (dt) od Ambionu. Táto zmes sa varila 5 minút pri 65 ° C a potom sa ochladila na 42 ° C. Nasledovalo pridanie:

3. Materiál a metódy 35 2 μl 10x RT pufor 2 μl 10x dntp 1 μl MMLV RT (reverzná transkriptáza) 2 μl (= 20 μci) P 33 -α datp (Amersham) RT sa uskutočňovala pri 37 ° C počas 1 2 hodín . Čistenie cdna Najprv sa uskutočnilo štiepenie RNAsou H, aby sa odstránila RNA. Na tento účel sa k vzorke pridal 1 ul RNAázy H a zmes sa inkubovala 30 minút pri 37 ° C. CDNA sa prečistila pomocou súpravy na odstránenie nukleotidov (Qiagen, Hilden). Po vyčistení sa vzorka eluovala z kolón 50 ul EDTA (50 mm). Konkurencia opakujúcich sa sekvencií cdna Kompetitívna zmes: 50 ul 20x SSC 70 ul 10 mm Tris ph 8,0 45 ul potkan Hybloc (1 mg/ml) (Applied Genetics Laboratories, Melbourne, Austrália) 20 ul 1% SDS Súťažná zmes a purifikovaná cdna sa denaturovala oddelene po dobu 5 minút pri 95 ° C a okamžite sa ochladila na ľade. Potom sa obe dávky spojili a inkubovali sa pri teplote 56 ° C počas 40 minút. Konkurenčná cdna sa pipetovala do čerstvého prehybridizačného roztoku a pridala sa ku génovým filtrom. Hybridizácia sa uskutočňovala najmenej 18 hodín pri 42 ° C v hybridizačnej peci.

3. Materiály a metódy 36 Premývanie filtrov Vzorka sa vyhodila a filtre sa premyli dvakrát počas 5 minút 2x SSC; 0,1% SDS sa premylo pri teplote miestnosti. Potom nasledovali ďalšie dva prísnejšie premývacie kroky pri 68 ° C s 0,2 x SSC; 0,1% SDS vždy 15 minút. Génové polia sa umiestnili medzi 2 vrstvy filtračného papiera, aby sa odstránila zvyšná kvapalina, a zabalili sa do fólie. Fosforové sito (Kodak, Stuttgart) sa aplikovalo asi 5 dní. Signál bol naskenovaný pomocou fosforového skenera (Molecular Dynamics, Amersham Biosciences, Sunnyville, CA) a vyhodnotený pomocou softvéru Array Vision 6.0 (Imaging Research).

4. Výsledky 37 4. VÝSLEDKY 4.1. REGULÁCIA NA ÚROVNI PROTEÍNOV 4.1.1. Expresia proteínov Src kináz Aby sa zistil vzorec expresie proteínov Src kináz v acinárnych pankreatických bunkách potkana, extrahovalo sa 20 ug celkového proteínu z izolovaných acínov potkaního pankreasu a separovalo sa elektroforézou. Proteín sa preniesol na membránu PVDF pomocou Western blotu a skúmal sa na expresiu všadeprítomne exprimovaných kináz rodiny Src. Boli použité protilátky proti kinázam Yes, Src, Lyn a Fyn. Áno a Lyn sú exprimované v acinárnych pankreatických bunkách potkana WAG, zatiaľ čo Src a Fyn nebolo možné detegovať (obr. 5). Pre kinázu Src používame kontrolu (bunkový lyzát bunkovej línie A431), pretože Src je v acinárnych bunkách opísaný v literatúre (Nozu et al. 1999). U našich potkanov však nie je možné detegovať kinázu Src. IB: Áno Lyn Fyn Src 1 2 3 4 5 Obr. 5: Expresia kináz rodiny Src v acinárnych bunkách potkana WAG. Dráhy 1 až 4: celkový proteín; Dráha 5: pozitívna kontrola na Src (bunkový lyzát z A431).