Regulácia autoimunitných chorôb prostredníctvom PTPN CT polymorfizmu a génu NCF1
Z Hertieho inštitútu pre klinický výskum mozgu na univerzite v Tübingene Katedra všeobecnej neurológie Úradujúci lekár: profesor Dr. A. Melmsova regulácia autoimunitných chorôb polymorfizmom C/T PTPN22 1858 * a inauguračnou dizertačnou prácou pre získanie doktorského titulu v odbore lekárska fakulta Lekárskej fakulty Univerzity Eberharda Karla v Tübingene prezentovanou Petrom Hoffmannom zo Stuttgartu Bad Cannstatt v odbore gén/pseudogénna štruktúra NCF1 2010
Dekan: profesor Dr. I. B. Autenrieth 1. spravodajca: profesor Dr. DR. R. Weissert 2. spravodajca: profesor Dr. T. Gasser
Obsah 1 Zoznam skratiek 1 2 Úvod a otázky 3 2.1 Komplexné genetické autoimunitné ochorenia 3 2.1.1 Definícia a epidemiológia 3 2.1.2 Etiológia a patogenéza 3 2.2 Myasthenia gravis a nereceptor proteín tyrozín fosfatázy 22 6 2.2.1 Myasthenia gravis 6 2.2.1.1 Definícia 6 2.2.1.2 Epidemiológia 6 2.2.1.3 Príznaky 6 2.2.1.4 Kurz 7 2.2.1.5 Novorodenecká myasthenia gravis 8 2.2.1.6 Sprievodné ochorenia 8 2.2.1.7 Neuromuskulárny prenos 8 2.2.1.8 Patogenéza 10 2.2.1.9 Význam týmusu 11 2.2.1.10 klinické klasifikácie a skóre 12 2.2.1.10.1 Klasifikácia podľa Ossermanna a Genkinsa 12 2.2.1.10.2 Myasthenia Gravis Score podľa Besingera 13 2.2.1.11 Diagnostika 13 2.2.1.11.1 Farmakologické testy 13 2.2.1.11.2 Opakovaná stimulácia pomocou elektromyografie 13 2.2.1.11.3 Diagnostika protilátok 14 2.2.1.12 Terapia 15 2.2.1.12.1 Inhibítory acetylcholínesterázy 15 2.2.1.12.2 Imunosupresívna liečba 16 2.2.1.12.3 Tymektómia 16 2.2.2 Nereceptor bielkoviny tyrozínfosfatázy 22 17 2.2.3 Výskumná otázka 18 2.3 Roztrúsená skleróza/malária a neutrofilný cytosolický faktor 1 19 I.
2.3.1 Roztrúsená skleróza 19 2.3.1.1 Definícia 19 2.3.1.2 Epidemiológia 19 2.3.1.3 Obrázok choroby 20 2.3.1.4 Formy kurzu 20 2.3.1.5 Diagnostické kritériá 21 2.3.1.6 Prognóza 24 2.3.1.7 Patogenéza 25 2.3.1.8 Diagnostika 27 2.3.1.8. 1 Diagnostika CSF 27 2.3.1.8.2 Elektrofyziologická diagnostika 28 2.3.1.8.3 Magnetická rezonančná tomografia 28 2.3.1.8.4 Stupnice na hodnotenie zdravotného postihnutia 28 2.3.1.9 Terapia 28 2.3.2 Malária 31 2.3.2.1 Definícia 31 2.3.2.2 Epidemiológia 31 2.3 .2.3 Vývojový cyklus parazita 31 2.3.2.4 Príznaky 32 2.3.2.5 Terapia 33 2.3.3 Reaktívne kyslíkové metabolity 33 2.3.4 Neutrofilný cytosolický faktor 1 35 2.3.4.1 Definícia 35 2.3.4.2 NADPH oxidáza 35 2.3.4.3 CF1 gén a pseudogény 2.3.3.4 NCF1 a autoimunitné choroby 40 2.3.5 Výskumná otázka 40 3 Materiál a metódy 41 3.1 Myasthenia gravis a PTPN22 41 3.1.1 Pacienti 41 3.1.2 Materiál a vybavenie 41 3.1.2.1 SNP genotypizácia 41 II
3.1.2.2 Anti-titínová protilátka Elisa 41 3.1.2.3 Anti-AChR protilátka, rádioimunotest 42 3.1.3 Metódy 42 3.1.3.1 SNP genotypizácia 42 3.1.3.1.1 SNP genotypová zmes 42 3.1.3.1.2 Taqman Universal Master Mix 43 3.1.3.1.3 Polymerázová reťazová reakcia, princíp 43 3.1.3.1.4 Genotypizácia, princíp 43 3.1.3.1.5 Polymerázová reťazová reakcia, implementácia 45 3.1.3.2 Protititínová protilátka ELISA 46 3.1.3.2.1 Enzýmom viazaný imunosorbentný test, princíp 46 3.1.3.2.2 ELISA na anti-titínové protilátky 46 3.1.3.3 Rádioimunologický test na anti-AChR protilátky 48 3.1.3.4 Štatistická analýza 48 3.2 NCF1 a roztrúsená skleróza/malária 49 3.2.1 Populácia pacientov 49 3.2.2 Materiál a vybavenie 50 3.2.2.1 Separácia DNA z celej ľudskej krvi 50 3.2.2.2 Genotypizácia NCF1 50 3.2.2.3 Elektroforéza na agarózovom géle 51 3.2.2.4 Bunková separácia monocytov a granulocytov 51 3.2.2.5 Počítanie a zriedenie polymorfonukleárnych buniek a mononukleárnych buniek periférnej krvi 52 3.2. 2.6 Označenie protilátky R-fykoerytrínom 52 3.2.2.7 Bradfordov test 53 3.2.2.8 Farbenie monocytov a granulocytov protilátkami p47-phox (D-10) značenými R-PE 53 3.2.3 Metódy 53 3.2.3.1 Oddelenie DNA od celej ľudskej krvi 53 3.2. 3.2 NCF1 genotypizácia 54 3.2.3.2.1 Taqman Universal Master Mix 54 3.2.3.2.2 Polymerázová reťazová reakcia 55 III
3.2.3.2.3 Genotypizácia 55 3.2.3.3 Elektroforéza na agarózovom géli 56 3.2.3.4 Bunková separácia monocytov a granulocytov 56 3.2.3.4.1 Bunková separácia 56 3.2.3.4.2 Separácia monocytov a lymfocytov 57 3.2.3.4.3 Separácia Granulocyty 57 3.2.3.5 Počítanie a nariedenie PMN a PBMC 58 3.2.3.6 Značenie protilátky pomocou R-fykoerytrínu 58 3.2.3.6.1 p47-phox (D-10): sc-17845 58 3.2.3.6.2 Značenie 58 3.2 .3.7 Bradfordov test 59 3.2.3.7.1 Princíp 59 3.2.3.7.2 Postup 60 3.2.3.8 Farbenie monocytov a granulocytov protilátkami p47-phox (D-10) značenými R-PE 60 3.2.3.9 Prietoková cytometria/Triedenie buniek aktivovaných fluorescenciou 61 3.2.3.9.1 Princíp 61 3.2.3.9.2 Prietoková cytometria 61 3.2.3.10 Štatistická analýza 62 3.2.3.10.1 Malária 62 3.2.3.10.2 Roztrúsená skleróza 62 4 Výsledky 63 4.1 Myasthenia gravis a PTPN22 63 4.1.1 Výsledky merania 63 4.1.2 Frekvencia alel a distribúcia genotypov 63 4.1.3 Frekvencie alel v podskupinách pacientov s SM 64 4.2 NCF1 a viacnásobné Skleróza/malária 66 4.2.1 kvocienty GT/GTGT a MS 66 4.2.2 kvocienty GT/GTGT sú spojené s subfenotypmi kvocientov MS 66 4.2.3 GT/GTGT a malária 69 4.2.4 Korelácia GT/GTGT Pomer s tvorbou ROS u pacientov s maláriou 70 IV
4.2.5 Kvocienty GT/GTGT a koncentrácia hemoglobínu 70 4.2.6 Prietoková cytometria monocytov, lymfocytov a granulocytov 71 5 Diskusia 73 5.1 Myasthenia gravis a PTPN22 73 5.1.1 Úvod 73 5.1.2 Asociácia polymorfizmu PTPN22 s myasthenia gravis 73 5.1.3 Asociácia polymorfizmu PTPN22 s výskytom anti-AChR protilátok a anti-titínových protilátok 73 5.1.4 Protititínové protilátky a tymómy 74 5.1.5 Genotypy v závislosti od stavu tymómu 75 5.1.6 Podskupinová analýza pacientov s MG bez tymómu 75 5.1.7 Porovnanie našich výsledkov s predchádzajúcimi štúdiami 76 5.1.8 Zhrnutie a výhľad 78 5.2 NCF1 a roztrúsená skleróza/malária 79 5.2.1 Úvod 79 5.2.2 GT/GTGT kvocienty u pacientov s roztrúsenou sklerózou 79 5.2.3 GT/GTGT kvocienty u pacientov s maláriou a porovnanie s produkciou ROS 80 5.2.4 Kritika metódy 81 5.2.4.1 Genotypizácia fragmentov NCF1 81 5.2.4.2 Prietoková cytometria monocytov, lymfocytov a granulocytov 82 5.2 .5 Zhrnutie a výhľad 82 6 Zhrnutie 83 6.1 Myasthenia Gravis a PTPN22 83 6.2 NCF1 a roztrúsená skleróza 84 6.3 NCF1 a malária 85 7 Bibliografia 86 Poďakovanie 104 Curriculum Vitae 105 V
Zoznam skratiek 1 Zoznam skratiek ACh = acetylcholín ACHR = receptor acetylcholínu, AIE = autoimunitných ochorení BSA = hovädzí sérový albumín CTLA4 = Cytotoxické T-lymfocytov Antigen 4 DNS = deoxyribonukleová kyselina EAE = experimentálna autoimunitná Encephalomy = Forster = experimentálna autoimunitná Encephalomy = Försterova Status Scale = Expanded Encephalomy = Försterova = Expanded Encephalomy = Försterova = Expanded Encephalomy stav ľudský leukocytový antigén IVIg = intravenózne imunoglobulíny KI = interval spoľahlivosti LYP = lymfoidná tyrozínfosfatáza MG = myasténia gravis MGB = spojivo malých drážok MHC = hlavný komplex histokompatibility MRT = magnetická rezonančná tomografia = MS = skleróza multiplex NADPH = nikotínamid cytofosfátový faktor 1 ALEBO NADPH = faktor 1 Nepárny pomer p47-phox = proteín47 fagocytová oxidáza PBMC = mononukleárne bunky periférnej krvi PBS = fyziologický soľný roztok pufrovaný fosfátmi PCR = polymerázová reťazová reakcia Phox = ox fagocytov idáza PMA = forbol-12-myristát-13-acetát PMN = polymorfné jadrové bunky 1
Zoznam skratiek PTPN22 = nereceptor proteín tyrozín fosfatázy 22 RA = reumatoidná artritída ROS = reaktívne metabolity kyslíka (reaktívne formy kyslíka) R-PE = R-fykoerytrín SSC = bočný rozptyl SLE = systémový lupus erythematosus SNP = polymorfizmus jedného nukleotidu 2
Úvod a výskumná otázka 2.2.1.8 Patogenéza V MG je hustota iónových kanálov AChR znížená na svalovej koncovej doske [Pestronk et al., 1985] a koncová doska je zničená. Synaptická medzera medzi nervovým koncom a postsynaptickou svalovou membránou sa zväčšuje [Engel a kol., 1976]. Iónové kanály AChR spojené autoprotilátkami sú endocytované a odbúravané rýchlejšie. Viazanie protilátky sprostredkované komplementom vedie k deštrukcii postsynaptického aparátu so znížením postsynaptického prstového aparátu (pozri obr. 2). Protilátky AChR priamo blokujú iónový kanál AChR [Köhler et al., 2003]. Znížený počet otvorených iónových kanálov AChR vedie k nižšiemu potenciálu vo svalovej koncovej doske, čo už nestačí na vytvorenie akčného potenciálu. Nižší počet aktivovaných svalových vlákien vedie k vyššie opísanej svalovej slabosti. Aj u pacientov s čisto očnými príznakmi dochádza k zníženiu AchR na koncoch končatín, čo však zostáva subklinické. A: zdravý neuromuskulárny prenos B: neuromuskulárny prenos u myasthenia gravis Obr. 2: Neuromuskulárny prenos [Drachman, D. B., 1994] 10
Úvod a výskumná otázka 2.2.1.9 Význam týmusu U pacientov s MG býva týmus morfologicky zmenený. Vyskytuje sa tymitída s lymfofolikulárnou hyperpláziou, atrofia týmusu alebo týmóm. Jedným z dôvodov tohto spojenia by mohla byť antigénna molekulárna mimika: vlastné alebo exogénne antigény, ktoré sú podobné epitopom iónových kanálov AChR, aktivujú autoreaktívne T bunky. Zložky vírusov herpes simplex alebo bakteriálnych infekcií, pri ktorých sa diskutuje o indukcii MG, sa môžu považovať za exogénne antigény [Schwimmbeck a kol., 1989]. V malígnom tymóme je zvýšená expresia neurofilamentov, ktoré by mohli fungovať ako autoantigénne determinanty, pretože majú epitop podobný AChR. Jeden nachádza tymómy v 8,5-15% prípadov u pacientov s MG [Wilkins et al. 1999, Loehrer 1999, Otto 1998]. 11
Úvod a výskumná otázka 2.2.1.10 Klinické klasifikácie a skóre 2.2.1.10.1 Klasifikácia podľa Ossermanna a Genkinsa Klasifikácia podľa Ossermana a Genkinsa (pozri tabuľku 1) bola vypracovaná s cieľom posúdiť závažnosť stavu ochorenia MG. Tabuľka 1: Klasifikácia myasthenia gravis podľa Ossermanna a Genkinsa (1971) Trieda Klinická forma Príznaky I Očná forma Ptóza, diplopia IIa Mierna generalizovaná forma Mierna generalizovaná slabosť IIb Faciofaryngeálna forma IIa + bulbárna slabosť III Ťažká akútna generalizovaná forma Akútna silná generalizovaná slabosť, bulbárne príznaky, respiračné zlyhanie IV ťažké chronické generalizované formy závažné, často progresívne generalizované slabosti 12
Úvod a otázka MG sa väčšinou vyznačujú orofaryngeálnou slabosťou a menším počtom očných symptómov [Evoli et al., 2003]. 2.2.1.12 Terapia Liečba MG je založená na nasledujúcich pilieroch [Köhler et al., 2003]: - Podávanie inhibítorov ACh esterázy, ktoré zlepšujú neuromuskulárny prenos, - Imunosupresívna alebo imunomodulačná terapia na zníženie antigénových protilátok. -Komplexná vyvolaná zápalová reakcia - Intervenčné terapeutické opatrenia na liečbu akútneho zhoršenia stavu, ako je myastenická kríza, napr. terapeutická výmena plazmy pomocou plazmaferézy alebo imunoadsorpcie [Shibuya et al., 1994] - tymektómia 2.2.1.12.1 Inhibítory acetylcholínesterázy Inhibítory ACh esterázy sa viažu v blízkosti katalytickej jednotky ACh esterázy a sú tam v porovnaní s ACh významne pomalšie. hydrolyzovaný. Karbamylová skupina sa kovalentne prenesie na ACh esterázu a niekoľko hodín inhibuje aktivitu enzýmu. Dodávka ACh v synaptickej medzere sa zvyšuje a ACh má viac času na obsadenie väzbových miest postsynaptickej membrány. Najbežnejšou účinnou látkou je pyridostigmínbromid (Mestinon) v dávkach až 300 mg/d. 15
Iniciácia a otázka sa diagnostikujú, ak dôjde k časovému a priestorovému rozšíreniu lézií, napr. je detekovateľný zobrazením (pozri tabuľku 2). Na diagnostiku SM je potrebné vylúčiť podobné klinické obrazy (napr. Kolagenóza, vaskulitída, borelióza alebo sarkoid). MS je vtedy, keď sú kritériá splnené, a klinické príznaky nie sú lepšie vysvetlené. Možný členský štát je v prípade podozrenia, ale kritériá nie sú úplne splnené. 22
Úvod a výskumná otázka FAD = flavín adenín dinukleotid Fe = železo GDI = inhibítor disociácie guanozín difosfátu GDP = guanozín difosfát GTP = guanozín trifosfát NADPH = nikotínamid adenín dinukleotid fosfát NADPH oxidáza, keď je aktivovaná, sa premieňa z svojich cytosolových a p-pho-phoxolových jednotiek jednotky viazané na membránu gp91-phox a p22-phox. Pre aktiváciu je nevyhnutná interakcia medzi p47-phox a jednotkami viazanými na membránu. V prvom rade sa musí Rac proteín oddeliť od Rho GDI proteínu a dostať sa do stavu aktivovaného GTP. Potom to môže prísť do súvislosti s plazmatickou membránou. Komplex plazmy vyžaduje niekoľko fosforylácií, aby sa spojil s jednotkami viazanými na membránu. Aktivovaná NADPH oxidáza produkuje superoxidové anióny, ktoré sa uvoľňujú do fagocytových vezikúl alebo do extracelulárneho priestoru [Heyworth et al., 2003]. Obrázok 3: Aktivácia NADPH oxidázy [od Heywortha a kol. 2003] 37
Úvod a výskumná otázka V ľudskom genóme sú na jeden gén NCF1 dva pseudogény (ψncf1), ktoré sú z 98% identické s génom NCF1 a nachádzajú sa v rovnakej oblasti 7q11.23 na chromozóme 7 [Heyworth, Cross a kol., 2003]. Rozlišuje sa medzi ogenenncf1 typu I, ktorý obsahuje deléciu GT na začiatku exónu 2, a typu II cncf1, ktorý neobsahuje deléciu GT [Heyworth, Noack a kol., 2002]. V populácii sú zvyčajne dva rôzne haplotypy, bežnejší haplotyp s dvoma kópiami typu I ψncf1 a jednou kópiou NCF1 a menej častý haplotyp s jednou kópiou typu I a typu II ψncf1 a jedna kópia funkčného génu [Heyworth et. al., 2002]. Častý výskyt mutácie GT pri chronickej granulomatóze možno hypoteticky vysvetliť rekombinačnými udalosťami medzi NCF1 a typom I ψncf1 (pozri obr. 4). Kvôli svojej blízkosti a vysokému stupňu podobnosti by sa také rekombinačné udalosti mohli vyskytovať častejšie. IIncf1 typu II pravdepodobne vzniká rekombináciou medzi NCF1 a Incf1 typu I. Obr. 4, model možného kríženia medzi NCF1 a Incf1 typu I [od Heywortha a kol., 2003] 38