Rýchle prispôsobenie sa dostupnosti potravy prostredníctvom dopamínom sprostredkovanej morfogenetickej odpovede
predmetov
abstraktné
úvod
Interakcie dravec-korisť môžu viesť k vývojovým a morfologickým reakciám s významnými ekologickými a evolučnými účinkami 1, 2, 3, 4, 5. Obrany vyvolané predátormi znižujú riziko konzumácie koristi, zatiaľ čo trestné činy vyvolané predátormi zlepšujú spotrebu alebo konkurencieschopnosť predátorov 1, 2, 3, 6, 7, 8. Tieto fenotypové zmeny môžu teda ovplyvňovať trofické interakcie, dynamiku populácií predátorov a koristi a dynamiku komunity a podporovať špecializáciu 1, 2, 6. Na pochopenie ich vývoja, obmedzení, adaptívnej hodnoty a funkčných dôsledkov je potrebné mechanické pochopenie týchto reakcií. 12 .
Na rozlíšenie, či sú dlhé ramená indukované pri nízkej hustote potravy, alebo naopak, či krátke ramená sú indukované pri vysokej hustote potravy, je potrebné určiť základný mechanizmus reakcie na jedlo. U lariev Strongylocentrotus purpuratus pred kŕmením k tejto vývojovej reakcii dôjde v priebehu niekoľkých dní a vyžaduje priame chemosenzovanie rias 15; Je teda pravdepodobné, že k tomu dôjde prostredníctvom neurosenzorického mechanizmu. Uvádzame, že dopamín je neurologická signálna dráha, cez ktorú mení pocit rias vývoj. Dopamínová signalizácia podporuje skrátenie dĺžky lariev od vývojového maxima. Preto táto korisť vyvolaná plasticita neočakávane nie je urážlivou reakciou na zlepšenie obstarávania zdrojov. Prostredníctvom experimentálnej manipulácie s dopamínovými signálmi a dĺžkou ramena hodnotíme náklady, výhody a obmedzenia tejto fenotypovej reakcie a poskytujeme dôkazy o tom, že larvy morského ježka si mohli pre vývojové reakcie zvoliť široko používanú cestu požitia.
Výsledky
Signál dopamínu vyvolaný riasami inhibuje predĺženie ramena
Diferenciálne interferenčné kontrastné obrázky lariev na konci obdobia pred kŕmením, deň 5, kultivované bez ( a ) a s ( ) Riasy začínajúce v štádiu gastruly. Dĺžky kostrových prvkov po požití a tela sú označené čiernymi čiarami. Kvantifikácia ( c ) dĺžka postorálneho ramena, čo predstavuje zmenu o 20,2% (± 3,9%), a ( d Dĺžka tela tyče predstavujúca zmenu o 3,9% (± 1,5%) pre larvy kultivované s (zelenými, n = 20) a bez (modrými, n = 18) riasami. Študentov obojstranný t-test, *** P
( a ) Zmena dĺžky postorálneho ramena a tela u 5-denných lariev, ktoré boli ošetrené agonistom DRD2 chinpirolom v špecifikovaných koncentráciách v porovnaní s kontrolou. Jednorazová ANOVA pre dĺžku postorálneho ramena, F 3,463 = 30,586, P
( a ) Zmena dĺžky postorálneho ramena a tela u 4-denných lariev, ktoré boli kultivované s riasami alebo bez rias ako kontrola (modrá) a translačné blokujúce MASO pri 0,4 mM (TH MAS01, svetlošedá). ANOVA (doplnková tabuľka S2), Liečba × Algae for Postoral Arms, F 1.286 = 19, 604, P 18 (doplnkový obrázok S2) a rozširuje procesy po celej dĺžke ciliárneho väzu (obr. 4e), ktoré by sa mohli podieľať na senzácii rias. Tieto údaje súhlasia s distribúciou dopamínových pozitívnych buniek v larvách S. droebachiensis 19 a s neurosenzorickou funkciou. Vyššie zväčšenie (× 40) embryí dvakrát zafarbených na dopamín a PMC marker naznačilo, že dopamínové pozitívne bunky bezprostredne susedili s PMC (4 g-j). Aj keď je sekundárny endokrinný signál 9 často neurostimulovaný v plastických fenotypových reakciách, blízkosť dopamínových pozitívnych buniek k PMC a nadložná ektoderma v postorálnych ramenách zvyšujú možnosť, že dopamín signalizuje priamo jednému alebo obidvom bunkovým typom, aby inhibovali rast ramena.
Fluorescenčná imunohistochemická detekcia enzýmu TH biosyntézy dopamínu, ktorý limituje rýchlosť, a markera PMC (SM30) ako referencia, 54 hodín po oplodnení (hpf) ( a ) a 60 hpf ( ). Biele šípky v týchto a nasledujúcich poliach označujú hrot postorálneho ramena. ( c ) Dĺžka postorálneho ramena v porovnaní s hpf, ktorá ukazuje súčasný začiatok predĺženia ramena a prvú detekciu TH-pozitívnych buniek (čierna šípka). Sivá prerušovaná čiara označuje približnú dĺžku počiatočného triradiate. Chybový pruh ± sem Fluorescenčná imunohistochemická detekcia dopamínu ( d ) a TH ( e ) a značky PMC, Msp130 ( d ) a SM30 ( e ), v štádiu plute (92 hpf). Fluorescenčná hybridizácia in situ s úplným pripojením na detekciu ddc mRNA ( f ) v postorálnom konci ramena a v serotonergných gangliách (hore na obrázku) na rannom pluteuse (72 hpf, pohľad z úst). ( g - j ) Vyššie zväčšenie obrázkov imunitných škvŕn dopamínu a PMC (Msp130) na špičke ramena. Jadrá zafarbené DAPI (modré). DA, dopamín DC, dopa dekarboxyláza. Mierka ( a - f ) 50 μm, ( g - j ) 10 μm.
Experimenty so zníženou reguláciou génov (obr. 3) a s narušením pôsobenia liekov (obr. 2 a 3), ktoré sa zameriavajú na dva nezávislé body v signálnej dráhe, ako aj s časovými a priestorovými vzorcami expresie dopamínu a biosyntetických dopamínových enzýmov (obr. 4) identifikovať dopamín ako kľúčový signál sprostredkujúci fenotypovú odpoveď na dostupnosť potravy. Bez dopamínového signálu sa plasticita stráca na dĺžku paže. Smer fenotypovej plasticity je teda jasný: Krátke ramená sú indukované pri vysokej denzite potravy, keď dopamínové signály inhibujú rozťahovanie kostry a tým podporujú štrukturálny rast.
Dôsledky požitia a skladovania materských lipidov
Ukázaním, že zapojenie dopamínovej signalizácie je zamerané na zníženie veľkosti potravinových ramien, sa nám tiež podarilo umelo manipulovať s veľkosťou potravinovej štruktúry, aby sa určila adaptačná kapacita. Testovali sme funkčné dôsledky na kŕmenie a spotrebu energie farmaceuticky rozdielnych veľkostí podávacieho zariadenia. Táto metóda bola výhodná pri rôznych koncentráciách rias, pretože larvy morského ježka môžu obsahovať exogénne rozpustený organický materiál 20, 21, ktorý by mohol zmeniť svoj metabolický stav, aj keď ešte nie sú kŕmené.
Predchádzajúce štúdie ukázali, že veľkosť kŕmneho zariadenia dobre koreluje s maximálnou rýchlosťou klírensu potravy v priebehu času vývoja 13, 22 a medzi rôznymi druhmi 23 lariev Echinoderm. Rozdiely vo veľkosti medzi druhmi alebo vývojovými štádiami (napr. 4-ramenné verzus 8-ramenné Echinoplutei) sú väčšie, ako sme tu pozorovali v jednom vývojovom štádiu u jedného druhu. Aby sme určili, či môžu relatívne malé zmeny v štruktúre kŕmenia významne ovplyvniť rýchlosť zachytávania rias, farmaceuticky sme upravili veľkosť kŕmnej štruktúry a potom sme larvám umožnili kŕmenie suspenziou mimetík na riasy. Zmeny v dĺžke postorálneho ramena významne korelovali s P
( a ) Regresia rýchlosti klírensu na dĺžke postorálneho ramena po 5 dňoch pri opakovaných pokusoch (kruhy, trojuholníky a kosoštvorce) pri 1 500 perlách na ml. Obe premenné sa normalizovali vzhľadom na pozorované maximá. Spoločná regresia modelu I, R2 = 0, 197, β 1 = 0, 866, P 2 = 0, 877, β 1 = 0, 287 ± 0, 14 (95% CI), n = 6. chybové pruhy ± sem
diskusia
Reakcia na kŕmenie lariev morského ježka, rovnako ako mnoho ďalších znakov vyvolaných korisťou, sa považuje za urážlivú a zvyšuje zháňanie potravy predátorov 2, 15. Naše údaje naopak ukazujú, že molekulárny mechanizmus v skutočnosti znižuje veľkosť kŕmnej štruktúry, keď sa zistia riasy. Signalizácia dopamínu vyvolaná riasami potláča štandardný vývojový program používaný pri predkrmovaní lariev na produkciu kratších ramien s nižším potenciálom kŕmenia.
V záujme zachovania fenotypovej plasticity by fenotypové zmeny mali maximalizovať vhodnosť pre dané prostredie. Ukazujeme, že fenotyp s dlhými ramenami maximalizuje kondíciu, keď je potravy nedostatok, a to zvýšením potenciálu získavania potravy na úkor materských lipidov. Zatiaľ čo fenotyp s krátkym ramenom maximalizuje kondíciu, keď je dostatok potravy, tým, že zachováva materské lipidy na úkor maximálneho potenciálu zásobovania potravinami. S touto vývojovou reakciou môžu súvisieť aj ďalšie kompromisy týkajúce sa fitnes, napríklad medzi dĺžkou paže a veľkosťou žalúdka 26 a/alebo plaveckým výkonom 27.
Možnosť priradenia zásob energie matky k iným účelom by mohla mať výrazné následky na prežitie a úspešnosť výkonu v niekoľkých fázach života prostredníctvom skrytých účinkov 28, 29, 30. Napríklad zvýšením ich alokácie pre vývoj mláďat môžu byť larvy schopné skrátiť čas, ktorý sú vystavení predátorom v planktóne, alebo sa môže zvýšiť kvalita vypúšťaných mláďat 29, 30. Pretože S. purpuratus má vysokú mieru úmrtnosti po osídlení so zriedkavými úspešnými náborovými udalosťami 31, 32, stav v čase osídlenia by mohol byť dôležitým faktorom riadiacim dynamiku populácií morských ježkov bentických, čo má dôsledky na úrovni komunity 33, 34. Keď sa frekvencia alebo závažnosť nesúladu frekvencií lariev a dostupnosti potravy zvyšuje, zníženie frekvencie rias počas fázy pred kŕmením vedie k zvýšenému výskytu lariev s dlhými ramenami a k strate akýchkoľvek výhod lariev s krátkym ramenom, ako je napríklad opätovné pridelenie zásob energie matky.
Naše údaje ukazujú adaptívne použitie dopamínových signálov na rýchlu zmenu vývoja kŕmnych štruktúr v očakávaní potravy. Iba prostredníctvom mechanistického porozumenia mohla byť táto zmena formy vyvolaná korisťou umiestnená do zodpovedajúceho ekologického a evolučného kontextu. Rôzne organizmy, od červov až po ľudí, používajú dopamínovú signalizáciu 35, 36 prostredníctvom dopamínových receptorov typu D2, najmä 37, 38, na predvídanie konzumácie potravy. U C. elegans 35, 38, hmyzu 39, 40, dospelých morských ježkov 41 a cicavcov vrátane človeka 36 mení dopamínový signál správanie v očakávaní požitia, zatiaľ čo larvy morských ježkov pred požitím menia svoj vývoj a tvar. Preto dopamínová signalizácia, ktorá sa podieľa na regulácii vývoja lariev, môže predstavovať alternatívu alebo posun od vysoko konzervatívneho používania dopamínovej signalizácie pri sprostredkovaní správania v očakávaní potravy.
Metódy
Kultúra embryí a lariev
Dospelé morské ježky, Strongylocentrotus purpuratus, od spoločností Cultured Abalone a Point Loma Marine Bezobratlých Lab, CalTech, sa udržiavali v morskej vode pri 10 ° C. Gaméty sa zbierali intracoelomovými injekciami 0,55 M KCI. Embryá sa kultivovali štandardnými metódami v hustotách 1 - 5 embryí na ml v umelej morskej vode (ASW) pri 15 ° C s riasami alebo bez rias (5 000 buniek na ml Dunaliella sp.) .
Kvantifikácia dĺžok kostry
Dĺžky postorálneho ramena a tela (každá n ≥ 20) sa určili z náhodnej vzorky, ktorá sa odobrala bezprostredne pred začiatkom kŕmenia 5. deň pf, s výnimkou embryí, ktorým sa injekčne podalo morfolino a ktoré sa odobrali po 4 dňoch pf, aby sa zabezpečilo, že tento morfolínový rozklad syntézy TH proteínu bol stále efektívny. Na umiestnenie kostrových prvkov do rovnakej roviny sa larvy vytlačili na podložné sklíčka mikroskopu a potom sa zobrazili inverzným mikroskopom Zeiss Axiovert 200 M pri 20-násobku pod rozdielnym inferenčným kontrastom, čím sa dajú ľahko identifikovať dvojlomné kostrové prvky. Dĺžky kostry boli kvantifikované z digitálnych obrázkov pomocou softvéru AxioVision (Carl Zeiss MicroImaging). V niektorých prípadoch (42, amisulprid, vysoko selektívny antagonista dopamínových receptorov D2/D3 43 a hydrochlorid metylesteru α-metyl-DL-tyrozín, selektívny inhibítor, narušený TH44, priamo zriedením v kultivačnom médiu (ASW) podávané plným súrodencom lariev v neskorom štádiu gastruly (48-52 hpf), pokiaľ nie je v texte uvedené inak. Farmaceutické experimenty sa uskutočňovali dvojmo s rôznymi pármi žena - muž.
Mikroinjekcie
Oplodnené vajíčka boli doplnené filtrovanými roztokmi obsahujúcimi 20% glycerín a rodamín-dextrán bez morfolínov (kontrola glycerínu), 0,4 mM TH MAS01 alebo 0,15 mM TH MASO2 pomocou mikromanipulátora Eppendorf Femtojet-Injectman NI2, Bol pripojený invertovaný fluorescenčný mikroskop Leica, mikroinjikovaný do (odkaz 45). Injekcie TH MAS01 sa replikovali s dvoma rôznymi pármi žena - muž. Porovnávali sa glycerol a neinjikované embryá a neboli pozorované žiadne významné zmeny v dĺžkach skeletu, imunofarbení TH alebo odpovedi na riasy. Niektoré neskoršie experimenty preto používali ako kontrolu neinjikované embryá. Blokovanie translácie TH MASO1 bolo vyvinuté na základe predpovedaného TH (GLEAN 00836) 5'UTR, ktorý bol potvrdený RASOU. TH MASO1: 5'-GCGTCCTGCTGTAGAAGATACTTGA-3 '. TH MASO2 sa zameral na hranicu intrónu 8/exónu 9, aby narušil katalytickú doménu enzýmu 46. TH MASO2: 5'-GCCTACGATGAACAAGAACAAATGT-3 '.
Štatistické analýzy pre dopamínové poruchy
Odozva na dávku dĺžky postorálneho ramena na liečbu chinpirolom sa hodnotila pomocou jednosmernej analýzy odchýlok (ANOVA), po ktorej nasledovalo párové porovnanie s kontrolou, ktoré bolo korigované Bonferroni, s cieľom určiť, či bola zmena oproti kontrole významná. Odozva na riasy sa hodnotila u farmaceutických porúch a porúch TH MASO1 trojcestnou metódou ANOVA, pri ktorej boli liečením porúch, liečením rias (verzus bez rias) a experimentálnou replikáciou fixné účinky a stredná štvorcová chyba ako menovateľ pomeru f 47 . Pretože všetky experimenty preukázali významnú (P> 0,05) interakciu medzi narušením a pôsobením na riasy pre dĺžku postorálneho ramena, uskutočnilo sa následné párové porovnanie korigované Bonferroni, aby sa zistilo, či je zmena vyvolaná riasami významná. TH MASO2 sa nereplikoval, a tak sa vyhodnotil pomocou Studentových dvojstranných t-testov. Všetky štatistické vyhodnotenia sa uskutočňovali v SYSTAT v10 s výstupom na tri desatinné miesta, preto sú pre P> 0,001 uvádzané presné hodnoty P.
Imunologické značenie a fluorescenčná hybridizácia in situ
Pokus o kŕmenie
Ošetrili sme polosúrodné larvy troch samíc ASW (kontrola), agonistom DRD2 (chinpirol) a antagonistom DRD2 (amisulprid), aby sme maximalizovali rozsah veľkostí kŕmnych štruktúr. Larvy z každého z týchto ošetrení boli spojené do troch replikovaných kultúr, prenesené do ASW na 4 hodiny a potom ošetrené jemne miešanou suspenziou imitácie rias, 10 um. m Polybead Microspheres (Polysciences, Inc) potiahnuté BSA pri 1 500 alebo 4 000, privádzané guľôčky na ml, po dobu 45 minút. Počet zachytených guľôčok a dĺžky skeletu boli merané pre najmenej 30 lariev z každej repliky, ako je uvedené vyššie. Medzi replikovanými vzorkami kŕmenými 1 500 guľkami na ml (dvojfaktorová ANOVA, dvojstranný P = 0,950, SYSTAT v.10) nebol žiadny významný rozdiel, preto sa replikáty zhromaždili a analyzovali pomocou regresie Model I.
Analýzy lipidov
Duplicitné kultúry, z ktorých každá pozostávala z nevlastných súrodencov troch samíc, sa pestovali v mierne miešaných 500 ml kadičkách v inkubátore pri 15 ° C. Na začiatku predĺženia ruky (
Normalizovaná priemerná dĺžka postorálneho ramena a hodnoty triglyceridov sa hodnotili pomocou Geometrického priemeru regresie 52 modelu II, aby sa zohľadnila chyba spojená s oboma premennými. Dĺžka postorálneho ramena bola normalizovaná na maximum. Koncentrácia triglyceridov sa normalizovala na počiatočnú koncentráciu v oplodnených vajíčkach (deň 0 pred štiepením). Ošetrenia v replikovanej kultúre mali rovnaké počiatočné koncentrácie triglyceridov, čo umožňovalo priame porovnanie medzi ošetreniami. Pretože nedošlo k žiadnej interakcii s kultúrami (dvojfaktorová ANOVA, obojstranná P = 0,478, SYSTAT v.10), boli tieto dve kultúry zhromaždené kvôli regresii.
Ďalšie informácie
Súbory PDF
Ďalšie informácie
Doplnkové obrázky S1-S4 a doplnkové tabuľky S1-S3
Poznámky
Odoslaním komentára vyjadrujete súhlas s našimi podmienkami používania a pokynmi pre komunitu. Ak zistíte, že niečo zneužíva alebo nie je v súlade s našimi podmienkami alebo pokynmi, označte to ako nevhodné.