Stanovenie a analýza knock-out myších modelov podjednotiek σ1 komplexu AP-1 - PDF
Zriadenie a analýza knock-out myších modelov podjednotiek σ1 komplexu AP-1 Dizertačná práca na získanie doktorandského titulu z matematicko-prírodovedeckých fakúlt Georg-August-Universität v Göttingene, prezentovaná Jennifer Baltes zo Saarbrücken Göttingen 2008
Rečník D7: prof. Dr. K. von Figura Institute for Biochemistry II, Center for Biochemistry and Molecular Cell Biology at the Georg-August University of Göttingen Co-lector: Prof. Dr. Inštitút pre mikrobiológiu a genetiku R. Ficnera na Georg-August-Universität zu Göttingen. Deň ústnej skúšky: 22. januára 2008.
Obsah I Obsah 1. Úvod. 1 1.1 Vezikulárna doprava. 1 1.1.1 Clathrin. 4 1.1.2.1 Tvorba vezikúl sprostredkovaná AP-1. 11 1.1.2.2 Motívy rozpoznávania adaptačných proteínových komplexov. 13 1.1.2.3 Interakcie AP-1 s doplnkovými proteínmi. 16 1.1.3 GGA adaptérov. 19 1.1.4 Transport sprostredkovaný AP-1. 22 1.2 Modely knock-out myši AP-1 Adaptine. 25 1.2.1 Fenotyp myší s vyradením y. 25 1.2.2 Fenotyp úl knock-out myší. 26 1.2.3 Fenotyp vyradených myší σ1b. 26 2. Otázka. 28 3. Materiál a metódy. 29 3.1 Často používané riešenia a zariadenia. 29 3.1.1 Nárazníky. 29 3.1.2 Kultúrne médiá. 29 3.1.3 Zariadenia. 30 3.1.4 Odstredivky a rotory. 30 3.2 Molekulárne biologické metódy. 31 3.2.1 Izolácia genómovej DNA z biopsií chvosta. 31 3.2.2 Precipitácia DNA etanolom. 31 3.2.3 Extrakcia DNA z fenol-chloroformu. 32 3.2.4 Izolácia RNA z tkanív. 32 3.2.5 Kvantifikácia nukleových kyselín. 33 3.2.6 PCR. 33 3.2.6.1 Metóda PCR na genotypizáciu myší σ1b -/- -. 35 3.2.6.2 PCR na genotypizáciu myší σ1a Gene Trap. 36 3.2.7 Reštrikčné trávenie DNA. 38 3.2.8 Separácia DNA gélovou elektroforézou na agarózových géloch. 38 3.2.9 Extrakcia DNA z agarózových gélov. 40 3.2.10 Ligácia fragmentov DNA. 41
Obsah III 3.5 Biochemické metódy proteínov. 58 3.5.1 Extrakcia celobunkového proteínu z buniek. 58 3.5.2 Produkcia tkanivového homogenátu. 58 3.5.3 Stanovenie proteínov podľa Bradforda. 59 3.5.4 Elektroforéza na polyakrylamidovom géli (SDS-Page) podľa Laemmli. 3.5.5 Prenos proteínov na nitrocelulózu (Western blot). 62 3.5.5.1 Polosuchá škvrna. 63 3.5.5.2 Vlhká škvrna. 63 3.5.5.3 Imunofarbenie na nitrocelulózových/PVDF membránach. 64 3.6 iné metódy. 66 3.6.1 ELISA na meranie sérových koncentrácií rôznych adipokínov. 66 3.6.2 FACS (triedenie buniek aktivované fluorescenciou) analýza izolovaných adipocytov. 67 3.6.3 Farbenie adipocytov olejovou červenou O. 67 4. Výsledky. 69 4.1 Fenotypizácia kmeňa myší s deficitom σ1b. 69 4.1.1 Vodná bilancia myší s deficitom σ1b. 4.1.2 Sérová analýza myší s deficitom σ1b. 78 4.1.3 Funkcia tukového tkaniva závislá od σ1b. 79 4.1.3.1 Charakterizácia tukového tkaniva. 80 4.1.3.2 Funkčné vyšetrenie tukového tkaniva. 83 4.1.3.2.1 Glukózová tolerancia myší s deficitom σ1b. 83 4.1.3.2.2 Koncentrácie adipocytokínov v sére. 85 4.1.2.3.2 Vplyv diéty s vysokým obsahom tukov na hmotnosť myší s deficitom σ1b. 87 4.1.3.3 Diferenciácia tukového tkaniva. 90 4.1.4 Štúdie správania na myšiach s deficitom σ1b. 100
Skratky V Skratky Å Ångström Obr. Obrázok naplnenie reklamy do konečného objemu a.d. aqua destillata ADP adenozíndifosfát AP adaptorový proteínový komplex APS persíran amónny ARF ADP-ribozylačný faktor BFA Brefeldin A bp pár báz BSA hovädzieho sérového albumínu C stupne Celzia CCV klatrín potiahnutý vezikul cdna doplnková DNA Ci Curie (2,22x10 6 počtov za minútu) COP Deoxyadenozíntrifosfát dctp deoxycytidín trifosfát DEPC dietylpyrokarbonát dgtp deoxyguanozín trifosfát, tj DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium dntp deoxyribonukleotid DMSO dimetylsulfoxid DNA deoxyribonukleová kyselina DTT EDTA desoxyribonukleová kyselina E-kolotrifosfát
Skratky VI EGF epiteliálny rastový faktor ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay En engrailed ENTH epsin N-terminálna homológia ER Endoplazmatické retikulum ERGIC ER-Golgiho prostredný kompartment ES embryonálne kmeňové bunky a kol. et alii (lat.: a ďalší) EtBr etídiumbromid FACS fluorescenčne aktivované triedenie buniek FKS fetálne teľacie sérum g gramy GAE γ-adapín-ucho-homológne GAP proteíny aktivujúce GTPázu GAPDH glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza GGA a TOM1 GDP guanozín trifosfát GDP-nukleotidový výmenný faktor GGA Golgiho lokalizované, γ-ucho obsahujúce, proteíny viažuce ARF GLUT4 transportér glukózy 4 GTP guanozín trifosfát h hod H20 voda tj. 2 O destilovaná voda HRP chrenová peroxidáza IgG imunoglobulín IP intraperitoneálne k kilo kb kilobázy ko knock out L liter LB lyzogenézny bujón M mol
Skratky VII ma miliampér MEF myš embryonálne fibroblasty mg miligram min. Minúta ml mililiter mm milimetr mm milimolárny mmhg milimetr ortuti MOPS kyselina 3- (N-morfolino) propánsulfónová MPR receptor manózy-6-fosfátu mrna messenger nm ribonukleová kyselina µg nanometer nanometer ribonukleová kyselina µg nanometr n-terminálny aminoterminálny OD optická hustota PAA polyakrylamid PBS fosfátový pufrovaný soľný roztok PCR polymerázová reťazová reakcia ph negatívny dekadický logaritmus protónovej koncentrácie PI-3-P fosfatidylinozitol-3-fosfát PI-4-P fosfatidylinozitol-4-fosfát PI-4,5P 2 fosfatidylinozitol-4, 5-bisfosfát PM plazmatická membrána pm pikomolárna PP2A proteínová fosfatáza 2A PVDF polyvinylidéndifluorid RNA ribonukleová kyselina RNAáza ribonukleáza RT izbová teplota rpm počet otáčok za minútu pozri SDS dodecylsulfát sodný
Skratky VIII SNARE SSC sec Tab. Taq TE TEMED TGN Tris U ü.n. UV V pozri VHS WT w/v v/v xg napr. "SNAP a NSF pripájacie receptory" štandardný soľný citrát druhá tabuľka Thermophillus aquaticus Tris/HCl EDTA N, N, N, N tetrametyldiamín trans-Golgiho sieť trishydroxymetylaminometánová enzýmová jednotka (jednotka) cez noc ultrafialové svetlo volty porovnajte Vps27p, Hrs a STAM hmotnosť divokého typu s Napríklad pomer objemu k objemu x-násobok zrýchlenia v dôsledku gravitácie
Úvod 7 je kolokalizovaný (Simpson a kol., 1997; Peden a kol., 2004). Doteraz nebol nájdený AP-3 v purifikovaných CCV z mozgového tkaniva (Simpson a kol., 1996; Dell'Angelica a kol., 1997b; Blondeau a kol., 2004). Funkčné štúdie s mutovaným väzbovým motívom AP-3 klatrínu tiež nepreukázali žiadnu interakciu. Zdá sa však, že v bunke existujú populácie spojené s klatrínom aj bez nich. (Peden et al., 2004). CCV viazané na AP-3 mohli byť izolované z bunkovej línie ľudského epitelu HeLa (Borner et al., 2007). Môže sa teda stať, že väzba klatrínu-AP-3 je veľmi krehká alebo že množstvo AP-3-väzbových, klatrínom potiahnutých vezikúl sa líši v rôznych bunkových typoch (Newell-Litwa et al., 2007). Komplex AP-4 nemá klasický klatrínový box a nezistila sa žiadna špecifická interakcia. Avšak AP-4 bol detekovaný v blízkosti klatrínu na snímkach elektrónového mikroskopu (Barois a Bakke, 2005). Obrázok 3: Špecifické transportné cesty sprostredkované adaptorovými proteínmi TGN: sieť Trans-Golgi; b ee: bazolaterálny skorý endozóm; ee: apikálny skorý endozóm; Lys: Lysosom, re: recyklácia endozómu pre ďalšie vysvetlenie pozri text (po Schu, 2005).
Úvod 9 má väzobné miesto, ale ul podjednotka, na rozdiel od u2, nemá väzbový motív fosfatidylinozitol fosfátu. Obrázok 4: Štruktúra a zloženie (a) AP-1 a (b) AP-2 Jednotlivé podjednotky sú identifikované zodpovedajúcimi farbami, ako je znázornené na schémach (b) a (d). Príslušné väzbové miesto YxxΘ je zvýraznené oválnym a väzbové miesto PI-4-P v AP-1 a väzbové miesto PI-4,5-P2 obsadené D-myo-inozitol-hexakisfosfátom (IP6) v AP2 krúžkom. V porovnaní s podjednotkou u2 nemá podjednotke ul AP-1 väzobné miesto pre fosfatidylinozitol. (Collins et al., 2002; Heldwein et al., 2004) Jadro komplexov adaptéra meria približne 100 Å x 80 Å, pričom pántová doména dvoch veľkých podjednotiek pravdepodobne siaha až do 200 - 300 Å nemá stabilnú sekundárnu štruktúru. Preto môžu byť ušné domény umiestnené ďaleko od jadra komplexu viazaného na membránu a interagovať s inými proteínmi v cytoplazme.
Úvod 10 Obrázok 5: Schematické znázornenie rôznych izoforiem podjednotiek AP-1. Pre y a ul sú známe dve izoformy. Pre σ sú dokonca opísané tri izoformy. σ1b sa detegoval v troch variantoch zostrihu. Pre mnohé z adaptínov boli izoformy opísané u cicavcov, ktoré sú kódované niekoľkými génmi. Varianty zostrihu sa našli iba pre a-adapín. V prípade AP-1 sa exprimuje najmenej jedna alternatívna izoforma pre všetky zúčastnené proteíny okrem podjednotky P1. Schematická kompilácia týchto proteínov je uvedená na obrázku 5. Izoforma y2 je zo 60% homológna s y1 adapínom. V oblasti variabilného závesu je skrátená. Na rozdiel od podjednotky y1 nie je možné v hybridnom systéme kvasiniek detegovať žiadnu interakciu medzi podjednotkou y2 a p. To naznačuje, že s y2 neexistuje žiadny komplex in vivo. Sú známe tri gény pre σ1-adapín, σ1a, -B a -C. Vykazujú 70-80% identitu na úrovni proteínu (Riel, 2004). In vitro sa σ1a a σ1b viažu na obidve y-izoformy (Takatsu et al., 1998; Takatsu et al., 2001). Okrem toho boli v našom laboratóriu vyrobené tri rôzne varianty spojov
Úvod 15 Všeobecne ich predchádza niekoľko kyslých aminokyselinových zvyškov, ktoré sa tiež nazývajú kyslé klastrové motívy dileucínu. V takom prípade nemožno aspartát (D) vymeniť. Na rozdiel od (D, E) xxxL (L, I) signálov sa DxxLL neviaže na AP komplexy in vitro, ale na monomérne adaptéry rodiny GGA (Puertollano et al., 2001; Zhu et al., 2001. ) (pozri 1.1.3). Ďalšia rodina triediacich motívov pozostáva zo sekvencie aminokyselín, ktoré obsahujú jedno až tri fosforylačné miesta pre kazeínkinázu II (CKII). Tento motív sa nachádza v mnohých transmembránových proteínoch, ktoré cirkulujú medzi TGN a endozómami. Fosforylácia pomocou CK-II je nevyhnutná hlavne pre spätný transport z endozómov do TGN. Pre proteín PACS1 (fosfofurínový kyslý klaster triediaci proteín 1) sa dalo preukázať, že viaže fosforylované, kyslé skupiny, ako aj AP-1 a AP-3. Väzbový povrch na AP-1 bol identifikovaný na u a σ (Wan a kol., 1998; Crump a kol., 2001).
Úvod 16 1.1.2.3 Interakcie AP-1 s prídavnými proteínmi Obrázok 6: Sieť AP-1 a jeho interakčných partnerov Spojovacie čiary medzi jednotlivými proteínmi symbolizujú interakciu. Boli opísaní ďalší interakční partneri, o ktorých sa predpokladá, že vytvárajú prostredie špecifické pre CCV AP-1. Väčšina z týchto doplnkových proteínov sa viaže na ušné domény veľkých podjednotiek AP-1, pričom interakcie y1 majú najvyššiu afinitu. Pretože tieto domény vykazujú najmenšiu podobnosť medzi adapínmi, vytvárajú sa veľmi špecifické spojenia. Na obrázku 6 sú zobrazené proteíny viažuce AP-1 a interakcie medzi zložkami sú symbolizované čiarami. Nie všetky tieto proteíny je možné podrobne rozobrať nižšie, preto sa obmedzím na tie, o ktorých je k dispozícii najviac informácií. Funkcie väčšiny týchto proteínov nie sú známe a dôležitosť väzby na AP-1 sa skúmala iba u niektorých. Posledná skupina zahrnuje ARF1GAP, ktorý je potrebný na rozpustenie proteínového obalu. Môžete tiež použiť Rabaptin5
Úvod je spôsobených 19 zvyškov týchto identifikovaných motívov, WVQF a WGDF, z týchto asociovaných proteínov (Mattera et al., 2004). 1.1.3 GGA adaptéry Monomérne GGA proteíny (Golgi-lokalizované, y-ucho obsahujúce, ARF viažuce proteíny) prispievajú k tvorbe proteínov potiahnutých klatrínom na TGN. GGA proteíny boli identifikované v databázach na základe homológie jednej z ich domén s doménou y-adapín-ucho a skúmané s ohľadom na ich úlohu v procesoch triedenia na TGN (Bonifacino, 2004). Nachádzajú sa tiež na endozómoch. U cicavcov boli opísané tri gény kódujúce GGA1, GGA2 a GGA3. Rodina je konzervovaná v eukaryotoch a kvasinky majú tiež dva proteíny GGA. GGA proteíny majú modulárnu štruktúru (pozri obrázok 7). Jeho tri zložené domény sú spojené neštruktúrovanými sekvenciami. Obrázok 7: Model štruktúry GGA1 Tu sa spojili štruktúry jednotlivých domén, aby vytvorili model, a jednotlivým doménam boli priradení ich väzobní partneri. Upravené od (Ghosh a Kornfeld, 2004)