Tandemová kvapalinová chromatografia; Prístup založený na hmotnostnej spektrometrii pre analýzu metabolitov

Zhrnutie

Tu popisujeme protokol extrakcie metabolitov zo Staphylococcus aureus a ich následnú analýzu pomocou kvapalinovej chromatografie a hmotnostnej spektrometrie.

Abstrakt

Úvod

Bakteriálne patogény čelia v hostiteľskom prostredí mnohým výzvam. Okrem priameho napadnutia imunitnými bunkami hostiteľ vylučuje aj živiny dôležité pre prežitie a replikáciu baktérií, čím vytvára výživovú imunitu 1, 2. Aby bakteriálne patogény prežili toto nepriateľské prostredie, zavádzajú faktory virulencie. Niektoré z týchto faktorov možno použiť na obchádzanie imunitnej odpovede baktérií; Ďalšími faktormi sú tráviace enzýmy, ako je hyaluronidáza, termonukleáza a lipáza, ktoré umožňujú baktériám doplniť živiny chýbajúce zo zložiek pochádzajúcich z tkanív 3, 4, 5. Baktérie skutočne vyvinuli regulačné systémy, ktoré viažu fyziologický stav bunky na produkciu faktorov virulencie 6, 7,> 8, 9, 10.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

1. Príprava tlmivých roztokov

  1. Pripravte fyziologický roztok pufrovaný fosfátmi (PBS; pH 7,4) zriedením zásobného roztoku 10 × PBS na konečnú koncentráciu 1x ultračistou vodou (destilovanou a deionizovanou) vodou.
  2. Pripravte kaliaci roztok zmiešaním 2 ml acetonitrilu, 2 ml metanolu, 1 ml ultračistej vody a 19 μl (konečná koncentrácia 0,1 mM) kyseliny mravčej.
  3. LC-MS rozpúšťadlo A sa pripraví pridaním kyseliny mravčej (konečná koncentrácia 0,2% [v/v]) do ultračistej vody.
  4. LC-MS rozpúšťadlo B sa pripraví pridaním kyseliny mravčej (konečná koncentrácia 0,2% [v/v]) k acetonitrilu.
    POZNÁMKA: Všetky roztoky by sa mali pripravovať s činidlami najvyššej čistoty, ktoré sú k dispozícii (zvyčajne s vysokou účinnosťou KVAPALINOVEJ CHROMATOGRAFIE). Roztoky by sa mali pripraviť čerstvo pred každým experimentom a pred použitím by sa mali skladovať na ľade.

2. Vytvorenie rovnovážneho stavu rastu S. aureus

  1. Sledované kmene S. aureus na izoláciu na tryptickom sójovom agare (TSA) zo zmrazeného zásobného roztoku glycerolu. Inkubujte 16-24 hodín pri 37 ° C.
  2. Naočkujte 4 ml tryptického sójového bujónu (TSB) alebo iného vhodného média do sterilných sklenených inkubačných skúmaviek s jednotlivými kolóniami každého kmeňa. Inkubujte naklonené (

Uhol 70 °) s rotáciou pri 60 otáčkach za minútu (ot./min.) Pri 37 ° C počas 16-20 hodín.
POZNÁMKA: Kultúry prenocovania sú náchylné na gradienty kyslíka, ak štandardné postupy vrátane tých, ktoré sú opísané v kroku 2.2, ovplyvňujú bunkovú fyziológiu. Takže používame stratégiu viacnásobného spätného riedenia na zabezpečenie biologického ustáleného stavu (pozri kroky 2.4-3.2 nižšie).

  • Pomocou spektrofotometra sa zmeria optická hustota kultúr z kroku 2.2 pri 600 nm (OD600). Ako optické referencie použite sterilné médium (prázdne). Tieto bunky sa zriedia na OD600 0,05 v 50 ml sterilného média TSB (predhriateho na 37 ° C) v samostatných 250 ml fľaštičkách DeLong.
  • Inkubujte kultúry za trepania pri 37 ° C vo vodnom kúpeli pri 280 otáčkach za minútu.
  • Každých 30 minút vykonajte merania OD 600; so zvyšovaním optickej hustoty bude možno potrebné kultúry zriediť TSB tak, aby zostali v rozmedzí lineárnej absorpcie spektrometra.
  • Pokiaľ majú kultúry z kroku 2.5 hodnotu OD 600

    Dosiahnite 0,8 - 1,0, subkultivujte ich v 50 ml 37 ° C na TSB na OD600 0,01 - 0,05 a opakujte kroky 2.4 a 2.5.

    0,4-0,5, pomocou sérologickej pipety odstráňte 13 ml kultúry z banky a naneste vzorku na filtre.

  • Po prefiltrovaní celej vzorky ihneď filter umyte ≥ 5 ml ľadovo vychladených metabolitov spojených s PBS médiom.
  • Uvoľnite vákuum a pomocou sterilných klieští vyberte filter z frity. Obráťte filter (bunkovou stranou nadol) v predchladenom ochladzovacom roztoku.
    POZNÁMKA: Je dôležité vykonať vyššie uvedené kroky rýchlo (tj. V priebehu niekoľkých sekúnd) a tak rýchlo, aby sa zabezpečil rýchly odrádzajúci prísun tekutín do buniek a zastavenie metabolickej aktivity.
  • Inkubujte filtre v ochladzovacom roztoku na suchom ľade po dobu ≥20 minút.
  • Pomocou sterilných klieští obráťte filtre (bunkovou stranou nahor) v Petriho miske a pomocou mikropipety uhaste bunky v ochladzovacom roztoku, aby ste opláchli membránu.
  • resuspendujte bunky v ochladzovacom roztoku a potom preneste bunkovú suspenziu do sterilnej 2 ml nárazuvzdornej skúmavky

    100 ul L 0,1 mm guľôčok oxidu kremičitého. Skladujte ju na suchom ľade alebo pri -80 ° C.

    1. Rozmrazte vzorky na mokrom ľade a vložte bunky do homogenizátora so štyrmi dávkami po dobu 30 s pri 6 000 otáčkach za minútu, pričom cykly interferujú s cyklami 2 minúty na suchom ľade.
    2. Lýzáty čírte 15 minút v predchladenej chladenej mikrocentrifúge pri maximálnej rýchlosti (t. J. 18 213 xg pri ≤ 4 ° C).
    3. Supernatant sa prenesie do čistej reakčnej skúmavky.
    4. Pomocou mikropipety preneste malú časť vzorky do mikrocentrifugačnej skúmavky na kvantifikáciu zvyškového obsahu peptidu v kroku 6; Zvyšok uložte pri -80 ° C.
      POZNÁMKA: Objem vyhradenej vzorky sa bude líšiť v závislosti od testu BCA v kroku 6.1. Táto vzorka by mala byť skladovaná na mokrom ľade na okamžitú analýzu alebo zmrazená pri -80 ° C.

    6. Stanovenie kyseliny bicinchonínovej (BCA)

    1. Vykonajte test BCA podľa odporúčania výrobcu súpravy s použitím vzoriek z kroku 5.4 na stanovenie zvyškovej koncentrácie peptidu pre každú vzorku.

    8. Dávková korekcia počtu iónov

    1. Určte každú vzorku, ktorá má slúžiť ako referenčná vzorka na dávkovú korekciu (napr. Divoký typ, replikácia 1).
    2. Vypočítajte súčet počtu iónov pre všetky metabolity v referenčnej vzorke. Tento výpočet opakujte pre všetky vzorky.
    3. Celkové číslo iónov každej vzorky vydelíme celkovým počtom iónov referenčnej vzorky, aby sa vytvoril pomer.
    4. Vydeľte iónové číslo pre každý metabolit vo vzorke pomerom vzorka/referenčný roztok, aby ste získali veľa korigované iónové číslo pre každý metabolit.

    1. Vydeľte počty iónov korigovaných v dávke pre každú vzorku získanú v kroku 8 koncentráciou peptidu stanovenou pomocou testu BCA v kroku 6, aby ste získali normalizovanú hodnotu pre každý metabolit.
      POZNÁMKA: Normalizované počty iónov po jednotlivých dávkach pre každý metabolit v kroku 9.1 je možné priamo porovnávať medzi kmeňmi a štatistickou analýzou (napr. Mann-Whitneyho U testom). Alternatívne je známe, že metabolit môže byť nezmenený buď liečbou, alebo môže byť použité genetické pozadie ako normalizačné zariadenie na detekciu zmien pomocou rozkladu metabolitu. Zahrnutie známeho množstva L-norvalínu alebo kyseliny glurárovej do extrakčného pufra sa môže použiť na korekciu straty počas spracovania vzorky 34.

    Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

    Reprezentatívne výsledky

    Analyzovali sme súbory intracelulárnych metabolických produktov v S. aureus počas rastu in vitro v bohatom komplexnom médiu. Ako dôkaz tohto princípu sme porovnali profily metabolitov medzi metycínom citlivou osteomyelitídou S. aureus izolovanou UAMS-1 (divoký typ [WT]) a izogénnym kmeňom, ktorému chýba globálny transkripčný regulátor CodY (Δ codY) 26. Rovnovážne exponenciálne kultúry kmeňov WT a codY sa ustanovili v médiu TSB, ako je opísané v kroku 2 protokolu. Chovanie pri raste kultúr divokého typu a mutantných codY-null bolo podobné, len s malými rozdielmi vo výťažku a rýchlosti rastu (Obrázok 1). Použitím technológie RNA-Seq a microarray sme my a ďalšie ďalšie gény zodpovedné za enzýmy podieľajúce sa na biosyntéze aminokyselín derivovaných z aspartátu boli potlačené v mutovanej c-nulovej codY v porovnaní s WT bunkami počas - vitro - rast v TSB (Obrázok 2) 25, 27, 30. Okrem toho sú v codY null mutante nadmerne exprimované 30, 35 a brnQ1 a brnQ2, permeaty pre aminokyseliny s rozvetveným reťazcom.

    Aby sme určili, do akej miery sú intracelulárne množstvá metabolitov v rovnovážnom stave spojené s touto cestou zmenenou u nulového mutanta, vykonáme profilovanie metabolitov na základe LC-MS. WT a codY-nulové mutantné bunky boli pestované do biologického ustáleného stavu a boli skenované podľa popisu v kroku 4 protokolu. Stanovili sme početnosť metabolitov prostredníctvom intenzity iónov plochy píku pre každú chromatograficky rozlíšenú integráciu metabolitov pomocou analytického softvérového balíka (pozri Bill of Materials). Opravili sme rozdiely v biomase normalizované nadbytkom metabolitov zvyškovej koncentrácie peptidu v každej vzorke. Tieto hodnoty sme tiež opravili kvôli možným dávkovým efektom medzi vzorkami v každej vzorke pre všetky metabolity, aby sme vypočítali priemerné iónové číslo a aby sme ako referenčnú hodnotu použili vzorku divokého typu. Tento prístup umožnil medzi vzorkami porovnanie množstva metabolitov v rôznych podmienkach. Porovnania medzi metabolitmi v rámci danej vzorky je možné dosiahnuť podobným spôsobom tak, že sa najskôr normalizuje množstvo metabolitov z počtu iónov metódou štandardného pridávania molárnych množstiev.

    Porovnávali sme hladinu kľúčových medziproduktov v aspartátovej dráhe v UAMS-1 a jej nulovom mutante codY. Ako v 3 Ako je možné vidieť, konečné produkty tejto dráhy (napr. Treonín a (izo) -leucín) sú bohaté na mutantné bunky bez obsahu codY, zatiaľ čo prekurzory (napr. Aspartát a acetyl homoserín) sú bohaté na bunky WT. Kombinovaná upregulácia proteínov BrnQ 36 a biosyntetickej dráhy ILV pravdepodobne vedie k zvýšeniu izoleucínu a leucínu 30. Aj keď sú rozdiely relatívne malé (29 určené analýzou RNA-Seq, je tiež potrebné poznamenať. DHP, 2,6-diaminoheptándioát ( 2,6-diaminopimelát).

    založený
    Obrázok 3: Frekvencie metabolitov v aspartáte - Rodina je zmenená na codY mutanta. Sú zobrazené log 2-násobné zmeny vybraných metabolitov v nulovom mutante codY v porovnaní s UAMS-1 (WT). Zmena sa určila vydelením priemernej frekvencie troch replikátov codY-nulového biologického kmeňa priemernou početnosťou troch biologických replikátov kmeňa WT. Štandardná chyba medzi biologickými replikátmi pre každý metabolit bola povinná. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

    Diskusia

    1,0, zriedený späť na OD 600

    0,05, vypestované a zozbierané, keď majú OD 600

    Dosiahnuté 0,5. Takýto postup tiež zriedi cytoplazmatické molekuly vrátane stabilných RNA a zároveň akumuluje rast cez noc. V skutočnosti je RNAIII, efektor systému snímania agr kvóra, jednou takouto RNA a reguluje expresiu niektorých rovnakých cieľových génov ako CodY 25, 43, 44. Kumulatívna RNAIII môže maskovať reguláciu závislú od CodY, čo vedie k podceneniu sily Represia alebo stimulácia pomocou CodY (Sharma a Brinsmade, nezverejnené výsledky).

    Obmedzením tejto analýzy je, že poskytuje okamžitý pohľad na množstvá metabolických produktov v bunke; z výsledkov týkajúcich sa zmien prietoku konkrétnou cestou nemožno vyvodiť nijaké závery. Napríklad množstvo lyzínu a metionínu medzi dvoma študovanými kmeňmi sa nemôže zmeniť, a to napriek derepresii biosyntetických enzýmov v úseku codY-zero (2 a 3). Kmeň codY-null môže v skutočnosti produkovať viac lyzínu a metionínu, ale môže sa rýchlo konvertovať na iné zlúčeniny; aby sa tieto molekuly nehromadili. Použitie 13 C alebo 15 N označených zdrojov uhlíka alebo dusíka by nám umožnilo sledovať uhlíkové a dusíkové kostry cez hlavné metabolické koridory 45, 46.

    Popísanou metódou sme vysvetlili zmeny v skupinách metabolitov u S. aureus, B. subtilis 29, Mycobacterium tuberculosis 47 a Enterococcus faecium 48, avšak túto metódu je možné použiť aj na ďalšie grampozitívne a gramnegatívne baktérie vrátane iných ľudských patogénov. ľahko sa pestuje v laboratóriu. Metabbolomická a transkriptomická integrácia informácií môže skutočne odhaliť neočakávané súvislosti medzi metabolizmom a virulenciou, ktoré by mohli viesť k novým stratégiám na liečbu infekcií.

    Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

    Zverejnenie

    Autori tvrdia, že nemajú finančné záujmy.