Technika oklúzie strednej mozgovej tepny na vyvolanie depresie po mozgovej príhode u potkanov

Zhrnutie

Tu uvádzame protokol indukcie depresie po mozgovej príhode u potkanov vylúčením strednej mozgovej tepny cez vnútornú krčnú tepnu. Na potvrdenie a hodnotenie indukovaných depresívnych nálad používame Porsoltov test núteného plávania a test preferencie sacharózy.

Abstrakt

Úvod

Mŕtvica patrí na štvrté miesto v zozname chorôb preukazujúcich smrť v USA z 1, 2, 3, pričom v rozvinutých krajinách spôsobuje najviac zdravotného postihnutia dospelých 4; Vďaka tomu je mozgová mŕtvica popredným uchádzačom medzi najväčšími zdravotnými problémami na svete. Normálnosť pozostalých preživších je zriedkavá, približne 15% - 40% pozostalých trpí trvalým zdravotným postihnutím, 20% vyžaduje ústavnú starostlivosť 3 mesiace po mozgovej príhode 5 a približne tretina šesťmesačných pozostalých vyžaduje od ostatných pomoc tiež Život. Cez každý deň 6. Mŕtvica je tiež považovaná za zodpovednú za zvýšenie výdavkov na zdravotníctvo v jednotlivých krajinách 7. American Heart Association odhaduje, že náklady spojené s prípadmi v USA v roku 2010 presiahnu 50 miliárd dolárov 8 .

Nielen, že mŕtvica spôsobuje dlhodobé škody, ale niektorí z tých, ktorí prežili, sú náchylní na prežívanie emocionálnych a behaviorálnych porúch, ako je demencia, únava, úzkosť, depresia, delírium a agresia 9, 10, 11, 12, 13, 14. Rekurentným psychologickým pokračovaním po mozgovej príhode je depresia diagnostikovaná po mozgovej príhode (PSD), ktorá je diagnostikovaná u približne 40% - 50% preživších 15, 16, 17. Depresia vyvolaná mozgovou príhodou vedie k zvýšenej morbidite a mortalite 18, 19, 20, 21, 22. Patofyziológia PSD nie je úplne objasnená, zdá sa však, že je spôsobená niekoľkými faktormi a je spojená s postihnutím, kognitívnym poškodením a léziami pri 23.

Potkaní model fokálnej mozgovej ischémie vytvorený MCAO je najbežnejšie používaným zvieracím modelom mozgovej príhody 24, 25, 26, 27. Demonštrácia zavedenia PSD u potkanov prostredníctvom oklúzie MCA prostredníctvom ICA využíva techniky, ktoré minimalizujú úmrtnosť a variabilitu v modeli MCAO.

Primárnym cieľom tohto protokolu je načrtnúť kroky na stimuláciu PSD u potkanov vylúčením MCA prostredníctvom ICA, modifikovaného modelu MCAO, ktorý znižuje úmrtnosť a výsledok variability28. Medzi konkrétne ciele patrí vykonávanie neurologických a histologických vyšetrení (stanovenie čísla neurologického zaostrenia [NSS], objemu infarktovej zóny a edému mozgu) na overenie účinnosti MCAO a použitie behaviorálnych testov na stanovenie vplyvu tohto postupu MCAO na Rozvíjanie emocionálnych porúch, najmä PSD.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

Výbor pre starostlivosť o zvieratá Univerzity Ben Gurion v Negeve v Izraeli schválil všetky liečebné a testovacie postupy použité v tomto protokole.

1. Pripravte potkany na prezentáciu pred pokusom

Trieda: Vyberte si dospelého samca potkana Sprague-Dawley s hmotnosťou 300 - 350 g.

  1. Potkany, štyri na klietku, vo viváriu pri 22 ° C a vlhkosti 40%, s obráteným cyklom 12 hodín svetlo/tma (svetlo od 8:00) a neobmedzeným prístupom k potrave a vode.
  2. Potkany náhodne rozdeľte do dvoch skupín, a to do skupiny MCAO (N = 24) a pubickej skupiny (N = 19).

2. Pripravte potkany na operáciu

3. Chirurgia (technika MCAO)

Trieda: Vykonajte chirurgický zákrok, ako je opísané v Boyko et al. 28 a používajú nástroje McGarry a kol. 29 a Uluç a kol., 30 .

  1. Urobte ventrálnu stredovú čiaru a rozrežte povrchovú fasciu.
  2. Opatrne urobte ostré a tupé oddelenie troch trojuholníkových svalov (sternohyoidné, digastrické a sternomastoidné svaly), aby ste identifikovali krčné tepny (ECA, ICA a spoločnú krčnú tepnu [CCA]).
  3. Opatrne rozobrať a vystaviť správne CCA a ICA.
  4. Oddeľte pravý CCA a ICA od nervu vagus.
    Trieda: Pri identifikácii krčných tepien identifikovaných v kroku 3.2 by bola ICA uznaná ako polovica vetiev CCA popri EDA.
  5. Vložte katéter (tepelne leptaný alebo silikónom potiahnutý nylon 4: 0) priamo cez ICA,

  1. Verejní činitelia dávajú intraperitoneálne 5 ml 0,9% soľného roztoku každému potkanovi, bezprostredne po operácii, aby sa zabránilo dehydratácii.
  2. Prvý deň po operácii bezpodmienečne podávajte lieky proti bolesti; Použite meloxikam 1 mg/kg SQ q24 h. Podajte zriedený Dipyron (0,5 g rozpustený v 400 ml pitnej vody) potkanom, u ktorých sa prejavia príznaky bolesti počas prvých 3 dní.
  3. Obete potkanov so záchvatmi (záchvaty sú spôsobené zvýšeným intrakraniálnym tlakom z mozgového edému alebo krvácania 28).

5. Skóre neurologickej závažnosti 31

Trieda: Tento zákrok vykonávajú dvaja pozorovatelia, ktorí sa chirurgického zákroku nezúčastňujú; Testujú neurologické deficity a motorické deficity stupňa na celkové skóre 0-4 32. Toto skóre je možné vyhodnotiť v rôznych časových intervaloch; Pri tejto skúške sa to robilo 50 minút, 24 hodín, 7, 15 a 30 dní po operácii. Tu sú kroky na hodnotenie NSS. Aj keď to v tejto situácii nie je potrebné, toto skóre je potrebné na určenie mozgovej príhody hlodavca na účely podania liečby.

  1. Potkana položte na keramickú podlahu a nechajte ju 1 minútu voľne sa túlať.
  2. Potkana jemne stiahnite dozadu za chvost a robte si starosti.
    1. Skóre potkana skóre 0 bez neurologického deficitu.
    2. Potkana ohodnoťte známkou 1 za prednú flexiu.
    3. Sorde potkana so skóre 2 za kontralaterálne slabé predkolenie.
    4. Skóre 3-bodového potkana pre cirkuláciu na hemiplegickej strane, keď je ťahaný za chvost.
    5. Potkajte potkana skóre 4 za spontánne krúženie 32.
      Trieda: Ak sa pozoruje viac ako jedna z odpovedí, uprednostňuje sa akcia s vyšším skóre.

6. Stanovenie objemu infarktu (histologické vyšetrenie)

7. Meranie mozgového edému 38

Trieda: Edém mozgu sa meral 24 hodín po poslednom MCAO. Eutanázia zvierat so závažnými neurologickými deficitmi, ktoré interferujú s jedením a pitím po dobu najmenej troch dní, s úbytkom hmotnosti viac ako 20%, hemiplegiou alebo záchvatmi.

  1. Posúďte veľkosť edému pravej hemisféry pomocou kompilácie čiastočne rozrezaných oblastí na výpočet objemov pravej a ľavej hemisféry v ľubovoľných jednotkách (pixeloch).
    Trieda: Po optickom skenovaní použite na tento výpočet softvér ImageJ 1.37v (rozlíšenie: 1 600 x 1 600 dpi). Vyberte záujmovú oblasť a použite funkciu merania z ponuky analýzy. Pri našom vyšetrovaní boli použité makra.
  2. Vyjadrte oblasť mozgu, zvyčajne edém, ako percento štandardných oblastí na neovplyvnenej kontralaterálnej hemisfére.
  3. Vypočítajte stupeň opuchu pomocou rovnice 39 vyvinutej skôr .

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Reprezentatívne výsledky

Histologické nálezy (stôl 1) vykazovali štatisticky významný objem infarktu ako percento z celkového mozgu v porovnaní so zvieratami v skupine s pubickou kontrolou (p Obrázok 2A) a mali dlhšiu dobu nehybnosti (p Obrázok 2B). V porovnaní s lonovými potkanmi.

strednej
Obrázok 1: Grafická ukážka časovej osi protokolu. Na schéme je možné vidieť rôzne testy, ktoré sa uskutočňujú na potkanoch v rôznych časoch: MCAO = oklúzia strednej mozgovej tepny na začiatku experimentu; NSS = číslo neurologického zaostrenia, 50 minút, 24 hodín a 7 a 30 dní po MCAO; A testy správania (preferencie sacharózy a Porsoltovo vynútené plavecké testy) od 30. do 33. dňa po MCAO. Tento údaj bol prevzatý z Ifergane et al. 45 zmenené. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

oklúzie
Obrázok 2: Test preferencie Sukro uskutočňovaný od 30. do 33. dňa s potkanmi po MCAO (n = 16) a pubikálnymi kontrolnými potkanmi (n = 14). Podiel (%) sacharózy. MCAO potkany konzumovali menej sacharózy (str. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

oklúzie
Obrázok 3: Porsoltov test núteného plávania od 30. do 33. dňa po MCAO (n = 16) a po fingovanej procedúre (n = 14). Trvanie pohybu (v sekundách). Čas nehybnosti v teste núteného plávania bol podstatne dlhší v skupine s MCAO ako v skupine s fingovaným testom (str. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Historické výsledky Zatvorte oklúziu skupiny mozgových tepien Hanbou zmietaná skupina
Celý mozog (objem infarktu) 8,8% ± 6,5 0,3% ± 0,1
Hema mozgu 10,2% ± 4,6 2,6% ± 1,2
Všetky údaje predstavujú skupinu ± S.E.M.

Tabuľka 1: Histologické nálezy pre objem infarktu a edém mozgu. MCAO = oklúzia strednej mozgovej tepny (n = 5); Lístok (n = 5).

Skóre neurologického zamerania Zatvorte oklúziu skupiny mozgových tepien Hanbou zmietaná skupina
50 minút po operácii 2,75 ± 0,14 0,0 ± 0,0
24 hodín po operácii 3,2 ± 0,15 0,0 ± 0,0
7 dní po operácii 0,91 ± 0,2 0,0 ± 0,0
Všetky údaje predstavujú skupinu ± S.E.M.

Tabuľka 2: Počet neurologických fokusov (NSS) pre MCAO a stydké potkany. MCAO = oklúzia strednej mozgovej tepny (n = 16); Lístok (n = 14). Táto tabuľka pochádza od Ifergana a kol. 45.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Diskusia

Jeden zo spôsobov, ako by sa tu prezentovaná technika MCAO mohla považovať za bezpečnejšiu ako pôvodný model MCAO, sa ukazuje, že nemá vplyv na ECA a jeho vetvy vrátane západnej artérie, terminálnych jazykov a maxilárnej artérie. Pri uzatváraní MCA nad ICA. Upustenie od ECA (a jeho pobočiek) pôvodným modelom MCAO prostredníctvom distálnej separácie a koagulácie látky 46 spôsobuje zhoršenú mastifikáciu, pretože je poškodený vaskulárny prísun do svalov. 47 Zničenie svalu by nakoniec mohlo spôsobiť uvoľnenie dodatočnej výpočtovej dynamiky tekutín. Na rozdiel od pôvodnej techniky MCAO, pri ktorej je prístup k MCA prostredníctvom ECA, je tu popísaná technika upravená pre cievnu mozgovú príhodu bez prerušenia prietoku krvi v ECA a jej prítokoch.

Hlavné argumenty v prospech nového modelu MCAO oproti pôvodnému modelu MCAO spočívajú v jeho schopnosti významne znížiť variabilitu edému mozgu, zmeny objemu a hmotnosti infarktu, ako aj znížiť úmrtnosť závislú od MCAO. Úmrtnosť pri postupe MCAO je dôležitým faktorom 48; Miera úmrtia 20 percent sa považuje za primeraných 49,50. Miera úmrtnosti (20% pre pôvodný MCAO, 12,5% pre nový MCAO a 0% pre kontrolu) v súčasnej štúdii bola v prijateľnom rozmedzí, ale nová technika MCAO fungovala lepšie ako pôvodná MCAO.

Potkany podrobené novému postupu MCAO schudli ihneď po operácii a na konci štúdie pribrali viac ako potkany podrobené pôvodnej technike MCAO 28. Viac úbytku hmotnosti a menej prírastku hmotnosti u potkanov podrobených pôvodnému MCAO by mohlo vyplynúť z väzivového účinku ECA počas operácie, čo by malo za následok distálnu hypoperfúziu v tvári, reči a mandibulárnych tepnách, ako aj poškodenie svalov pri ischemickej chorobe. Mastix. Ak je mastifikácia narušená, orálny príjem klesá, čo by spolu s katabolizmom mohlo byť zodpovedné za úbytok hmotnosti a z dlhodobého hľadiska zlé neurologické výsledky, chorobnosť a smrť 43. Prístup k MCA prostredníctvom ICA si nevyžaduje žiadne rušenie s EDA alebo jeho pobočkami. Počas nového postupu MCAO teda nie sú indukované žiadne nepriaznivé účinky a potkany, ktoré podstúpili tento zákrok, nezaznamenajú žiadne problémy s hmotnosťou, chorobnosťou alebo úmrtím.

Testy používané na hodnotenie základných depresívnych faktorov, ako sú depresívne správanie, anhedónia, nehybnosť a poruchy učenia a pamäte, sú štandardnými postupmi používanými na zvieracích modeloch depresie v rokoch 51, 52. Skúška správania, podobne ako Porsoltov test núteného plávania, je po MCAO často ovplyvnená neobvyklou motorikou. Tu sa tento test použil 30 až 33 dní po chirurgickom zákroku na stanovenie toho, že indukcia PSD u modifikovaných potkanov MCAO neovplyvnila neprimerane ich motoriku. Podľa výsledkov vykazovali potkany z testovanej skupiny celkové únikové správanie porovnateľné s chovaním potkanov. MCAO potkany mali signifikantne viac zlyhaní pri úteku, signifikantne dlhšie trvanie nehybnosti a nižšiu preferenciu pre sacharózu v porovnaní s ovčími zvieratami. To by naznačovalo, že táto technika MCAO je schopnou alternatívou k pôvodnej metóde MCAO.

Rozdiel medzi zahrnutím a vylúčením potkanov v postupe MCAO pre širšie experimentálne hodnotenie veľmi závisí od výsledku operácie. S modelom indukovaným PSD indukovaným MCAO by mohli byť obsiahnuté niektoré nežiaduce vedľajšie účinky MCAO, čo by ponechávalo priestor na zahrnutie menších a možno krehkejších potkanov do postupu MCAO. Tu prezentovaný zvierací model MCAO poskytuje scenár na zníženie neúmyselných výsledkov nasledujúcich po PSD vyvolaných MCAO, pretože má potenciál na zníženie variability zmien hmotnosti, edému mozgu a objemu infarktu a úmrtí súvisiacich s MCAO. Táto technika by potenciálne mohla slúžiť ako nástroj na hodnotenie budúcich terapií PSD a poskytnutie predklinických údajov o účinnosti terapeutických látok, ako aj na sledovanie ďalších faktorov, ktoré menia modality klinického výsledku pri mozgovej príhode a PSD.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.