Vplyv cholesterolu na motilitu vonkajších vláskových buniek morského slimáka
Vplyv cholesterolu na pohyblivosť vonkajších vláskových buniek morského kochley a na prestín motorických bielkovín Johannes Michael Schmid
Z kliniky a polikliniky pre ušné, nosné a krčné lekárstvo na Univerzite Ludwiga Maximiliána v Mníchove Riaditeľ: Prof. Dr. med. Alexander Berghaus Vplyv cholesterolu na motilitu vonkajších vláskových buniek morského kochley a na motorickú bielkovinu Prestin Dizertačná práca pre získanie doktorátu z medicíny na Lekárskej fakulte Univerzity Ludwiga Maximiliána v Mníchove, ktorú v roku 2011 predniesol Johannes Michael Schmid z Mníchova
So súhlasom Lekárskej fakulty Univerzity v Mchensku Spravodajca: Spoluspravodajca: Priv.-Doz. DR. med. M. Canis prof. Dr. Magdaléna GÉtz prof. Dr. Frank Staub Dean: Prof. Dr. med. DR. h.c. M. Reiser, FACR, FRCR Deň ústnej skúšky: 09.06.2011
I Obsah Obsah Strana I. Úvod. 1 1. Dôležitosť sluchu. 1 2. Anatómia vnútorného ucha. 2 3. Fyziológia kochley. 5 3.1 Prenos zvuku a tonotopia. 5 3.2 Endokochleárny potenciál a mechanoelektrická transdukcia. 5 3.3 Zosilnenie signálu vonkajšími vlasovými bunkami. 7 3.4 Prenos informácií vnútornými vlasovými bunkami. 11 4. Prestín motorových bielkovín a jemná štruktúra bunkovej membrány vonkajších vláskových buniek. 11 4.1 Identifikácia Prestinu. 11 4.2 Jemná štruktúra bunkovej membrány vonkajších vláskových buniek. 12 4.3 Štrukturálna štruktúra a lokalizácia prestínu. 13 4.4 Funkcia Prestin. 15 5. Nelineárna kapacita a elektromotilita vonkajších vlasových buniek. 16 6. Cholesterol a jeho vplyv na sluchový proces. 17 6.1 Chemická štruktúra a všeobecný význam. 17 6.2 Dôležitosť cholesterolu pre plazmatickú membránu. 19 6.3 Účinky cholesterolu na vnútorné ucho. 20 7. Otázky a ciele. 24 II.Materiál a metódy. 26 1. Materiál. 26 1.1 Zariadenia. 26 1.2 Spotrebný materiál. 27 1.3 Chemikálie a roztoky. 27 1.3.1 Chemikálie. 27 1.3.2 Riešenia. 28 1.4 Softvér. 29
III Obsah 2. Pohyblivosť vonkajších vláskových buniek za fyziologických podmienok. 53 3. Vplyv cholesterolu na motilitu vonkajších vlasových buniek. 55 3.1 Všeobecné úvahy. 55 3.2 Závislosť motility vonkajších vláskových buniek od koncentrácie cholesterolu. 56 3.2.1 Vplyv cholesterolu na maximálne skrátenie a maximálne predĺženie. 56 3.2.2 Vplyv cholesterolu na maximálny sklon, na priemerné zmeny dĺžky a na napätie V pkc. 58 3.3 Vplyv cholesterolu na prestín motorových bielkovín a na bunkovú membránu vonkajších vláskových buniek. 60 3.3.1 Vplyv chloridu na motilitu vonkajších vláskových buniek. 60 3.3.2 Vplyv cholesterolu s polovičnou maximálnou funkciou prestínu. 62 V. Zhrnutie a výhľad. 64 VI. Zoznam skratiek. 68 VII. Zoznam obrázkov. 69 VIII. Zoznam tabuliek. 71 IX. Bibliografia. 72 X. Poďakovanie. 78 XI. Publikácie. 79 XII. Pokračovať. 81
I. Úvod 4 Obrázok 1: Anatómia vnútorného ucha A: Prehľad s rozrezanou otvorenou kochleyou B: Prierez cievkami kochley C: Schematické znázornenie orgánu Corti s vonkajšími a vnútornými vlasovými bunkami (upravené od Hudspeth 2000 a Knirsch 2007) (Knirsch 2007 )
7 I. Úvod sa pohybuje medzi -60 mV a -80 mV (Rajagopalan et al. 2007) (obrázok 3). Hnacou silou týchto iónových prúdov je potenciálny rozdiel medzi membránovým potenciálom vlasových buniek a endokochleárnym potenciálom (Klinke et al. 2005; Schmidt 2007; Speckmann et al. 2008). Obrázok 3: Receptorový potenciál ako funkcia vychýlenia stereovilli (modifikované podľa Speckmann et al. 2008 a Rajagopalan et al. 2007) 3.3 Zosilnenie signálu vonkajšími vlasovými bunkami Príliv iónov do ETC a súvisiace zmeny potenciálu aktivujú zosilňovaciu funkciu ÄHZ (Breneman et al. 2009). Táto výstužná funkcia je založená na dvoch mechanizmoch, somatickej a ciliárnej motilite. Oba mechanizmy pri aktívnych pohyboch EHZ zvyšujú vibrácie cestujúcej vlny až 1000-krát (Schmidt 2007; Dallos 2008). Pri ciliárnej motilite k tomu dochádza aktívnymi pohybmi stereovilov, zatiaľ čo somatická pohyblivosť je založená na predĺžení a skrátení bunkového tela. Tento mechanizmus, známy ako kochleárny zosilňovač, zvyšuje frekvenčnú selektivitu a citlivosť sluchového orgánu. Sú ÄHZ ototoxickými látkami
I. Úvod 10 Obrázok 5: Ciliárna motilita (upravené od Fettiplace 2006 a Breneman et al. 2009) Ak vezmeme súčasné výsledky výskumu dohromady, Hudspeth navrhol, aby ciliárna motilita predstavovala akýsi predzosilňovač a frekvenčný modulátor, zatiaľ čo somatická pohyblivosť funguje ako konečný zosilňovač mohol (Hudspeth 2008). Kochleárny zosilňovač pracuje dynamicky. Ponúka možnosť zosilnenia veľmi nízkych intenzít zvuku, zatiaľ čo veľké intenzity zvuku sú spracovávané bez zosilnenia. Predchádza sa tak poškodeniu vnútorného ucha. Automatická regulácia zosilnenia vo forme inhibičných účinkov zaisťuje mechanické vyváženie. Najlepšie skúmaný inhibičný účinok sprostredkuje neurotransmiter acetylcholín. Acetylcholín je hlavným prenášačom eferentných vlákien, ktoré inervujú EHZ. Väzbou na špecifické receptory prúdi Ca 2+ do bunky. To vedie k oneskorenému odtoku K +, a tým k hyperpolarizácii bunky. To vedie k zníženiu citlivosti na napätie ETC a k inhibícii elektromotility (Frolenkov 2006; Ashmore 2008).
12 I. Úvod. Liberman a kol. dokázali túto teóriu potvrdiť v roku 2002. Ukázali, že keď boli odstránené exóny 3 - 7 kódujúceho génu, myši mali stratu produktov skreslenia otoakustických emisií (DPOAE) a elektromotility EHZ, ako aj zvýšenie prahu sluchu o 40 - 50 dB (Liberman et al. 2002). 4.2 Jemná štruktúra bunkovej membrány vonkajších vláskových buniek Prestín motorového proteínu sa takmer výlučne nachádza v bočnej bunkovej membráne ÄHZ (Ashmore 2008) (obrázok 6). Obrázok 6: Štruktúra bočnej bunkovej membrány vonkajšej vlasovej bunky (upravené od Oghalai et al. 1998) Na apikálnom konci ETC sú stereovilli pripevnené k kutikulárnej doštičke. Jadro je v spodnej časti bunky. Bunková membrána bočnej steny má jedinečnú trojvrstvovú štruktúru. Vonkajšia vrstva je plazmatická membrána (PM), v ktorej je zabudovaných 3000 až 6000 molekúl prestínu na µm². Hustota prestínu závisí od umiestnenia ETC v kochlei. Apikálny EHZ, že
I. Úvod 14 Trojrozmerná rekonštrukcia Prestina od Mio a kol. Výsledkom bol proteín s rozmermi 7,7 nm x 7,7 nm x 11,5 nm vo forme guľovej pištole s vnútornými dutinami (Mio et al. 2008) (obrázok 8). Obrázok 7: Schematické znázornenie štruktúry a lokalizácie prestínu v plazmatickej membráne vonkajších vlasových buniek (upravené podľa Ashmore 2008) Obrázok 8: Trojrozmerné znázornenie prestínu v plazmatickej membráne (upravené podľa Mio et al. 2008)
17 I. Úvod Porovnanie s výskumom zmien v dĺžke ÄHZ s inými metódami, napr. videomikroskopia použitá v tejto práci (Ashmore 2008). Obrázok 10: Grafické znázornenie NLC, pohybu náboja a zmeny dĺžky ako funkcie membránového potenciálu (upravené z Ashmore 2008) Mnoho faktorov, ako napr. stav fosforylácie intracelulárnych proteínov alebo látok, ako je chloroform, gadolínium, salicyláty alebo cholesterol, môže ovplyvniť tieto procesy. Tieto krivky posúvate buď v depolarizačnom alebo v hyperpolarizačnom smere alebo meníte veľkosť najväčšej zmeny dĺžky alebo najväčšieho pohybu náboja. V tejto práci bol konkrétne skúmaný vplyv cholesterolu na motilitu EHZ (Ashmore 2008). 6. Cholesterol a jeho vplyv na sluchový proces 6.1 Chemická štruktúra a všeobecný význam Laureát Nobelovej ceny Michael Brown opísal cholesterol ako molekulu s Janusovou hlavou (Berg et al. 2007). Na jednej strane je nepostrádateľnou súčasťou našich buniek, na druhej strane poškodzuje ľudský organizmus napr. v dôsledku aterosklerózy (Yeagle 1985). Cholesterol predstavuje podstatnú súčasť plazmatickej membrány väčšiny
25 I. Úvod Aby bolo možné rozlišovať medzi cholesterolom na bunkovej membráne a na prestíne motorického proteínu, musí sa prestínová funkcia ETC znížiť znížením koncentrácie intracelulárneho chloridu na asi 50% (Oliver et al. 2001). ETC s polovičnou funkciou prestínu sa potom rozdelia do dvoch testovacích skupín. Prvá skupina sa vyšetruje s koncentráciou extracelulárneho cholesterolu 1,0 mmol/l, druhá skupina bez pridaného cholesterolu. Vyhodnotenie týchto experimentov by malo potom zodpovedať otázku, či je vplyv cholesterolu skôr výsledkom účinkov na pasívne vlastnosti bunkovej membrány alebo je založený skôr na účinku na funkciu prestínu motorického proteínu.
II. Materiál a metódy 26 II. Materiál a metódy 1. Materiál 1.1 Príprava zariadenia Stereomikroskopický zdroj studeného svetla Príprava roztokov Osmeter s elektronickým bodom mrazu Wild M3C KL 1500 Osmomat 030 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Nemecko Schott AG, Mainz, Nemecko Gonotec GmbH, Berlín, Nemecko Pipety Referencia Hamburg, Eppendorf AG, Patch Clamp Stimulation Glass Electrode Patcher Patch Clamp Table/Faraday Cage Patch Clamp Amplifier Patch Pipette Holder/Preamplifier DMZ Universal Puller Micro-g Axopatch 200A CV-201A headstage Germany Zeitz Instruments GmbH, Martinsried, Nemecko TMC, Peabody, MA, USA Axon Instruments Inc., Foster City, CA, USA Axon Instruments Inc., Foster City, CA, USA
27 Analógovo-digitálny prevodník Mikromanipulátor Digidata 1200 Model XR-6 Videozáznamy Mikroskop Axiovert 135 Videokamera Moticam 2000 II Materiál a metódy Axon Instruments Inc., Foster City, CA, USA Narishige Scientific Instrument Lab., Tokio, Japonsko Carl Zeiss AG, Göttingen, Nemecko Motic Deutschland GmbH, Wetzlar, Nemecko 1.2 Spotrebný materiál pre pipetovacie špičky 10 µl, 100 µl, 1000 µl kapiláry z borosilikátového skla GC150TF-10 Petriho miska potiahnutá poly-L-lyzínom (Ø 35 mm) Eppendorf AG, Hamburg, Nemecko Clark Electromedical Instruments, Pangbourne, Reading, UK Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Nemecko 1.3 Chemikálie a roztoky 1.3.1 Chemikálie pentansulfonát sodný vo vode rozpustný cholesterol HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA Biochrom AG, Berlín, Nemecko
II. Materiál a metódy 28 1.3.2 Roztoky Pipetové roztoky (intracelulárne roztoky) (v mmol/l) Látka Štandardný roztok Roztok s chloridom 6 mmol/l KCl 140 6 Pentánsulfonát sodný 0 134 MgCl 2 6H 2 0 2 2 EGTA 11 11 CaCl 2 0, 1 0,1 Hepes 10 10 KOH na nastavenie hodnoty ph 7,2 glukózy na nastavenie osmolarity 315 - 320 roztokov kúpeľa mosmol/l (extracelulárne roztoky) (v mmol/l) roztoky štandardných roztokov látok s (roztokom HBSS) 0,1 mmol/l, 0,5 mmol/l, 1,0 mmol/l, 1,5 mmol/l cholesterol 0 cholesterol CaCl 2 1,25 1,25 glukóza 5,55 5,55 KCl 5,4 5, 4 KH 2P04 0,35 0,35 MgSO 4 7H 2 O 0,81 0,81 NaCl 137 137 Na 2 HPO 4 2H 2 O 0,34 0,34 Hepes 5 5 NaOH pre nastavenie hodnoty ph 7,2-7,4 glukózy na úpravu osmolarity 300-310 mosmol/l
II. Materiál a metódy 32 Obrázok 13: Konfigurácie merania techniky patch-clamp a ich výroba (upravené od Numberger 1996) 1. Konfigurácia pripojená k bunke: Konfigurácia pripojená k bunke zodpovedá východiskovej polohe pre všetky ostatné konfigurácie. V tejto konfigurácii nie je možné zasahovať do intracelulárneho prostredia bunky. Bunka sa meria v stave, v ktorom sú všetky proteíny vrátane iónových kanálov v prirodzenom prostredí na intracelulárnej strane membrány. Iba oblasť pod pipetou, náplasťou, je riadená extracelulárnym potenciálom zosilňovača.
II. Materiál a metódy Bolo vybavených 34 pohyblivých mikroskopických stolov. Zväčšený obraz bol zaznamenaný digitálnou videokamerou (Moticam 2000, Motic Deutschland GmbH, Wetzlar, Nemecko) a uložený digitálne do počítača. Na umiestnenie pipety s náplasťou sa použil hydraulický mikromanipulátor (model XR-6, Narishige Scientific Instrument Lab., Tokio, Japonsko). Kúpeľová elektróda vo vnútri pipety s náplasťou bola pripojená k predzosilňovaču (CV-201A headstage, Axon Instruments Inc., Foster City, CA, USA). Obrázok 14: A: Štruktúra meracej stanice svoriek na náplasť B: Zväčšenie tabuľky mikroskopu o Petriho misku a pipetu s náplasťou (upravené podľa Scheel 2002) (Scheel 2002) Podtlak potrebný na odsávanie buniek bol vytvorený pomocou perfúznej striekačky pripojenej k držiaku pipety. Predzosilňovač bol pripojený k zosilňovaču (Axopatch 200A, Axon Instruments Inc., Foster City, CA, USA),
37 II. Materiál a metódy 2.2.6 Meranie odporu elektródy a korekcia ofsetu Pipeta bola naplnená a upnutá do držiaka pipety tak, aby bol koniec pipety ponorený do roztoku kúpeľa. Mierny pretlak zabránil upchatiu pipety nasatými časticami. S programom pclamp 8 bol generovaný negatívny testovací impulz s napätím 5 mV po dobu 5 ms. Z výslednej prúdovej odozvy program vypočítal odpor elektródy na základe Ohmovho zákona. Tento odpor bol v testoch medzi 3 MΩ a 6 MΩ (obrázok 15 A). Obrázok 15: Zmena odporu a odozvy prúdu na testovací impulz vyvolaný patchovou pipetou ako funkcia konfigurácie upínacieho aparátu patch (upravené z Numberger 1996).
II. Materiál a metódy 38 Napätia, ktoré nepochádzajú z bunky alebo zo skúšobného impulzu, sa nazývajú offsetové potenciály (Numberger 1996). Tieto potenciály vyvolané polarizáciou elektród striebra/chloridu strieborného a prechodnými potenciálmi medzi rôznymi koncentráciami elektrolytov v kúpeli a pipete môžu falšovať výsledky merania. Tieto potenciály musia byť kompenzované pomocou svorkového zosilňovača pred každým meraním a nemali by presiahnuť 10 mV (Numberger 1996). 2.2.7 Celulárna-Patch-svorka a stimulácia Vhodné vitálne bunky sa vybrali pod mikroskopom pri malom zväčšení. Na stanovenie buniek sa použili kritériá vitality Zajica a Schachta (Zajic a kol. 1987). Bunky vykazovali strnulo vyzerajúce stereovilly, bunkové jadro umiestnené na bazálnom póle, mierne náhodné pohyby cytoplazmatických častíc a dôsledne neporušená bunková membrána (obrázok 16). Obrázok 16: Izolovaná vonkajšia vlásková bunka so zvyškami podporného tkaniva a pipety s náplasťou