Vplyv indukovateľnej hemoxygenázy (HO-1) na mikrocirkuláciu v
1 Z kliniky chirurgickej univerzity, oddelenia všeobecnej a vnútornej chirurgie na Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.br. Vplyv indukovateľnej hemoxygenázy (HO-1) na mikrocirkuláciu pri postischemickej pankreatitíde I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N na získanie titulu lekár z Lekárskej fakulty Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.br. V roku 2006 predstavil Moritz Scholtes narodený v Aachene
2 2 Dekan: Prof. Dr. med. C. Peters 1. recenzent: PD Dr. med. O. Thomusch 2. recenzent: Prof. Dr. med. B. Členenie Rok promócie: 2007
4 4 Na túto prácu dozeral Dr. med. E. von Dobschütz
5 5 OBSAH 1. ÚVOD AKÚTNA PANKREATITÍDA MIKROKROKULÁCIA ISCHÉMIA REPERFÚZIA HEMDEGRADÁCIA HEMOXYGENÁZOU Reakcia hemoxygenázy a jej produktov železo CO biliverdín a bilirubín HO-izoenzým pre-izoenzýmový experiment anestézia a ventilácia Mikrochirurgické technológie vyšetrovacie metódy Macrohemodynamics Microhemodynamics Funkčné kapilárnej hustota leukocytov-endoteliálny interakcie Laboratórne parametre Stanovenie detekcie aktivity HO Northern blot analýza Western blot analýza experimentálny protokol testovaných skupín Skúšobný postup kontrolných podmienok aktivity ischemicko-repaemitis-hemogenase inhibícia-okysličenie-inhibičná aktivita ischémia-repemeritis-hemogenase-inhibičný-oxygenázy-inhibícia aktivity aktivity ischémia-re-creatitis-hemogenase-STA-oxygenázy-okysličenie pankreatické aktivity. 35
6 6 4. VÝSLEDKY MAKROHAEMODYNAMIKA MIKROHAEMODYNAMIKA Funkčná hustota kapilár Leukocyt-endoteliálna interakcia LABORATÓRNE PARAMETRE DETEKCIA HEMOXYGENÁZY Detekcia aktivity Northern blot Western blot PREHĽAD DISKUSIA DISKUSIA DISKUSIA DISKUSIA Northern-Blot VÝSLEDKY Vplyv ischémie a reperfúzie Makrohemodynamika Mikrohemodynamika Interakcia leukocytov a endotelu Hemoxygenázová expresia a aktivita Vplyv HO Makrohemodynamika Mikrohemodynamika Leukocytová a endoteliálna interakcia Expresia a aktivita hemoxygenázy. 98
10 10 Tieto mechanizmy vedú k poruche mikrocirkulácie, ktorá vedie k zníženému prívodu energie do tkaniva a udržuje tak začarovaný kruh (obrázok 1). Na + -K + - ATPáza Na + -Ca 2+ - antiport ATP Na + Ca 2+ Proteázy XDh O 2 Hyx + XOx Ischémia Krv-O 2 Reperfúzia O 2 -radikálna permeabilita Edém Trombóza Zrážanie leukocytov Degradácia ECM Porucha mikrocirkulácie Aktivácia leukocytov Poškodenie buniek Poškodenie endotelu Enzýmy Cytokíny Obrázok 1: Začarovaný kruh ischemicko-reperfúzneho poškodenia: Procesy pri ischémii (hore) spôsobujú poškodenie buniek pri reperfúzii (dole), čo vedie k ďalšiemu hypoxickému poškodeniu tkaniva
17 17 2. CIEĽ ŠTÚDIE Cieľom tejto experimentálnej štúdie bolo zistiť vplyv hodinovej ischémie a dvojhodinovej reperfúzie na mikrocirkuláciu pankreasu. Skúmalo sa, či a ako sa podmienky v čase menia. Ďalej by sa malo určiť, či a akým spôsobom ovplyvňuje tieto podmienky exogénna indukcia indukovateľnej hemoxygenázy (HO-1). Skúmala sa najmä funkčná hustota kapilár ako parameter stavu zásobovania výživou pri reperfúzii a interakcia leukocytov a endotelu ako parameter skorej zápalovej reakcie. Na stanovenie týchto parametrov bola použitá metóda intravitálnej epifluorescenčnej mikroskopie. Vplyv hemoxygenázy na jej expresiu a aktivitu bol overený molekulárnou biológiou. Podľa výskumnej otázky je práca rozdelená do nasledujúcich častí: 1. Účinky ischémie a reperfúzie na mikrocirkuláciu pankreasu bez exogénneho vplyvu na hemoxygenázu 2. Účinky indukcie hememoxygenázy na mikrocirkuláciu pankreasu pri postischemickej pankreatitíde
22 22 Obrázok 5: Schematický priebeh ciev v pankreatických artériách (od HOFFMANN 70)
24 24 Japonsko) a dátum a čas sa zobrazia a zaznamenajú na obrazovku monitora (WV-BM 1700, uhlopriečka 41 cm, Panasonic, Mníchov). Použitím vyššie uvedených zväčšovacích zariadení (mikroskop, CCD kamera, monitor) sa dosiahlo celkové zväčšenie približne 680x. CCD ZG SVHS IVM TV Obrázok 6: intravitálne mikroskopické experimentálne nastavenie: Krysa s pankreasom pripevneným k slezine pod epifluorescenčným mikroskopom (IVM: intravitálny mikroskop, CCD: kamera s nabíjacím prístrojom, ZG: časovač, SVHS: videorekordér, TV: monitor) funkčné Hustota kapilár Funkčná hustota kapilár je dĺžka [cm] kapilár perfundovaných červenými krvinkami v pomere k ploche pozorovanej oblasti [cm2]. Do hodnotenia nie sú zahrnuté kapiláry, ktoré nie sú prekrvené alebo boli prekrvené iba plazmou. Na vizualizáciu plazmy sa intravenózne injikovalo 0,15 ml hovädzieho albumínu označeného fluoresceínizotiokyanátom (FITC-albumín, A-9771, 0,75%, Sigma-Aldrich Co, Deisenhofen, Nemecko). Po excitácii svetelným zdrojom emituje fluorochrómový fluoresceínizotiokyanát svetlo s vlnovou dĺžkou nm, ktoré cez vstupný filter vytvára kontrastný obraz mikrocirkulácie