Vplyv obmedzenia kalórií na intestinálnu permeabilitu, zápalové markery a stolicu

predmetov

abstraktné

úvod

Na základe pozorovania, že obezita súvisí s chronickým, vysoko zápalovým stavom a pravdepodobne so zníženou črevnou permeabilitou 7, bola cieľom tejto štúdie preskúmať, či obmedzenie kalórií môže modulovať črevnú permeabilitu, a tým znížiť markery zápalu u ľudí. Ďalej sa skúmala diverzita a zloženie črevnej mikrobioty, ako aj ich možná súvislosť s črevnou permeabilitou a zápalom.

Výsledky

Diéta so zníženým obsahom kalórií mala za následok úbytok hmotnosti

Do štúdie bolo zaradených 20 žien (priemerný vek 46, 8 ± 11, 5) a žiadna účastníčka nevypadla. Fyzikálne a biochemické charakteristiky účastníkov pred intervenciou, bezprostredne po hypokalorickej diéte a 14 dní po intervencii, sú uvedené v tabuľke 1. Účastníci boli požiadaní, aby jedli stravu (800 kcal/deň) a ďalších 200 g zeleniny. V porovnaní s pôvodným príjmom kalórií 1 698, 1 ± 592, 7 kcal/deň, spôsobila táto intervencia značný energetický deficit (P 23, 24, vykázal významný pokles po obmedzení príjmu kalórií (P 25.). Koncentrácia v plazme na začiatku štúdie sa významne zvýšila po 4-týždňovej hypokalorickej intervencii od (str

( a - d ) Boxové grafy založené na prahových hodnotách cyklu (CT) biopsií tukového tkaniva od 18 účastníkov pred a po štvortýždňovom obmedzení kalórií. ( e ) Pre priemery tukových buniek boli k dispozícii údaje od 8 účastníkov. *** P 2 a znížená na 4 020 ± 773 μm 2 (n = 8, P = 0,31).

Intervencie spustili jednotlivé zmeny profilov mikrobioty v stolici

Aby sme dokázali rozlíšiť medzi znížením kalórií a úbytkom hmotnosti, vyšetrili sme účastníkov po návrate k vyváženej strave na udržanie hmotnosti po dobu dvoch po sebe nasledujúcich týždňov. Údaje naznačujú, že väčšina zmien pozorovaných pri nízkokalorickej diéte zmizla, čo naznačuje, že tieto zmeny sú skôr dôsledkom akútneho a hlbokého obmedzenia kalórií ako mierneho poklesu telesnej hmotnosti, ktorý zaznamenali účastníci. počas dvoch týždňov sledovania významne nepribrala.

Ako sa dalo očakávať, plazmatické koncentrácie zápalového markera hsCRP sa po VLCD znížili, čo je v súlade s literatúrou 28. Merali sme tiež cirkulujúci LBP ako náhradný marker pre translokáciu zložiek bunkovej steny z gramnegatívnych baktérií, čo je termín známy ako derotoxická endotoxémia spojená s črevom 9. Zníženie obsahu kalórií malo za následok pomerne mierny pokles hladiny LPB 29, čo je v súlade s výsledkami meraní intestinálnej permeability a s tým spojeným poklesom zápalových markerov. Návrh štúdie však neumožňuje vyvodiť jednoznačné závery o možnej príčinnej súvislosti medzi translokáciou endotoxínov a systémovým zápalom.

Plazmatické hladiny leptínu sa významne znížili, zatiaľ čo HMW adiponektín sa po intervencii zvýšil. Naproti tomu hladiny MCP-1 zostali nezmenené. Jedným z vysvetlení by mohlo byť, že priemerný pokles hmotnosti o 7% je príliš malý na to, aby mal väčší vplyv na markery zápalu súvisiace s obezitou 30. Okrem toho boli zmeny v génovej expresii pre vybrané markery v tukovom tkanive - s výnimkou leptínu - pravdepodobne malé kvôli obmedzenému úbytku hmotnosti. Napriek významnému zníženiu hmotnosti nebolo pozorované žiadne významné zníženie veľkosti tukových buniek podkožného tukového tkaniva v oblasti brucha. Existuje však trend k znižovaniu strednej veľkosti adipocytov. Verhoef a kol. ukázali, že 10% zníženie hmotnosti sprostredkovalo významné zníženie veľkosti adipocytov 31 .

Intervencia bola tiež spojená so zvýšeným výskytom jednej OTU v rodoch Ruminococcus a Bifidobacterium, ktorá zahŕňala produkty degradácie potravín komplexných polysacharidov aj polysacharidy odvodené od hostiteľa40. Santacruz a kol. tiež preukázali zvýšenie počtu qPCR u Bifidobacterium spp. po chudnutí (-6,9 kg) u obéznych dospievajúcich po 10 týždňoch redukcie kalórií 41 .

Sila našej štúdie spočíva v prísnej štandardizácii a komplexnej fenotypizácii účastníkov. Ďalej bola použitá široká škála rôznych metód na charakterizáciu vplyvu VLCD na intestinálnu permeabilitu: Metabolický stav bol hodnotený pomocou oGTT; Stav zápalu sa skúmal pomocou rôznych cirkulujúcich parametrov a génovej expresie vo vzorkách tukového tkaniva. Výsledky boli ďalej podporené údajmi týkajúcimi sa črevnej mikrobioty, ktoré sledovali individuálny vzorec. Na lepšie pochopenie týchto heterogénnych reakcií sú potrebné ďalšie štúdie.

Na záver naše údaje naznačujú, že 4-týždňová diéta VLCD má priaznivé účinky na funkciu črevnej bariéry u obéznych žien, ktorá po návrate k bežnej strave rýchlo zmizne. Možný príčinný vzťah medzi zmenami v črevnej permeabilite a zmenami pozorovanými v metabolických a zápalových biomarkeroch, ako aj v určitých cieľových baktériách, si vyžaduje ďalšie skúmanie.

Účastníci a metódy

Protokol o štúdiu bol skontrolovaný a schválený etickou komisiou Lekárskej fakulty Technickej univerzity v Mníchove (schválenie č. 5499/12). Štúdia bola založená na pokynoch Medzinárodnej konferencie o harmonizácii správnej klinickej praxe a Helsinskej deklarácie (v revidovanej verzii zo Soulu v Južnej Kórei 2008). Pred zaradením do štúdie bol od všetkých účastníkov získaný písomný informovaný súhlas. Štúdia bola zapísaná do nemeckého registra testov (DRKS00006210). Dátum podania nemeckého registra testov bol 11. júna 2014.

Účastníci štúdie

Dvadsať účastníkov s BMI ≥ 30 kg/m² bolo prijatých v októbri 2013 prostredníctvom inzerátov v oblasti Mníchova. Oprávnenosť zúčastniť sa bola hodnotená pomocou podrobného skríningového dotazníka s podrobnosťami o anamnéze. Kritériá vylúčenia boli: BMI

Študovať dizajn. Schéma poskytuje prehľad harmonogramu a rôznych vykonaných vyšetrení. Skratky: BS, vzorka krvi; FB, biopsia tuku; FS, vzorka stolice; GP, črevná priepustnosť; IC, nepriama kalorimetria; MRI, magnetická rezonancia; NC, Nutričné poradenstvo; PE, fyzická skúška; oGTT, orálny glukózový tolerančný test; dotazník.

Stravovacie protokoly

Účastníci štúdie dostali pokyn, aby zaznamenávali svoju spotrebu potravy počas celého obdobia štúdie. Energetický obsah a zloženie makroživín v strave boli vypočítané pomocou softvéru OptiDiet Plus (verzia 5.1.2.046, GOE mbH, Linden, Nemecko).

Antropometrické merania

Antropometrické a klinické merania sa štandardizovali medzi 8. a 9. hodinou ráno po hladovke cez noc. Telesná hmotnosť a zloženie sa merali pomocou prístroja TANITA Body Composition Analyzer Type BC-418 MA III (Amsterdam, Holandsko). Pokojová metabolická rýchlosť (RMR) sa merala pomocou krytu striešky (COSMED Quark RMR, Fridolfing, Nemecko).

Vzorky krvi a biochemická analýza

Počas pôstu boli odobraté vzorky krvi. Parametre lipidov (celkový cholesterol, LDL-c, HDL-c, triglyceridy), pečeňové enzýmy (aspartát transamináza (AST), alanín transamináza (ALT), γ-glutamyltransferáza (γ-GT)), kreatinín, kyselina močová a glukóza nalačno boli stanovené spoločnosťou SynLab (Mníchov, Nemecko) analyzované. Odobrala sa ďalšia vzorka krvi, ktorá sa ihneď centrifugovala (2 500 g po dobu 10 minút pri 20 ° C) a potom sa skladovala pri -80 ° C až do analýzy. V plazme boli leptín, chemerín, hsCRP, RANTES, MCP-1, HMW-adiponektín a LBP (všetky: výskum a vývoj, Wiesbaden, Nemecko), inzulín (Dako, Glostrup, Dánsko) a zonulín (Immundiagnostik AG, Bensheim, Nemecko). sa testovali pomocou komerčne dostupných enzýmových imunosorbentných testov (ELISA). Fekálny kalprotektín sa meral pomocou ELISA (CALPROLAB ™ Calprotectin ELISA (HRP), FROST Diagnostika GmbH, Otterstadt, Nemecko). Všetky testy ELISA sa uskutočňovali podľa pokynov výrobcov. NEFA sa merali pomocou komerčnej testovacej súpravy (Wako Chemicals GmbH, Neuss, Nemecko). Inzulínová rezistencia bola odhadnutá pomocou HOMA-IR [HOMA-IR = inzulín (μU/ml) × glukóza (mmol/l)/22, 5] 42.

Orálny glukózový tolerančný test

Testy orálnej glukózovej tolerancie (OGTT) sa začali medzi 8. a 9. hodinou po 12 hodinovom hladovaní cez noc. Po odbere základnej vzorky krvi dostávali subjekty 75 g glukózy v objeme 300 ml (AccuCheck®-OGT, Roche, Mannheim, Nemecko). Po 30, 60 a 120 minútach sa odobrala krv a stanovila sa hladina glukózy (HemoCue Glukóza 201 +, plazmovo kalibrovaná, Ängelholm, Švédsko).

Črevná priepustnosť

Obštrukčná funkcia čriev sa hodnotila pomocou rôznych neinvazívnych testov. Najskôr sa zmerala črevná permeabilita pomocou validovaného testu absorpcie cukru a testu s PEG. Oba testy sa uskutočňovali paralelne. Princíp spočíva v meraní vylučovania orálne podávaných látok s rôznymi molekulovými hmotnosťami. Testy sa uskutočňovali tesne pred zákrokom, po zákroku a dva týždne po zákroku. Údaje sú uvedené ako percento požitého cukru a percento PEG nájdených v moči. Tieto hodnoty sú známe ako% obnovy moču. Na záver sa zmeral v krvi marker črevnej permeability zonulín pomocou testu ELISA.

Skúška absorpcie cukru

Test absorpcie cukru sa uskutočňoval podľa popisu Normana a kol. 43. Cukry boli kvantifikované vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou s pulznou elektrochemickou detekciou (chromatografický modul: 250, Dionex, Idstein, Nemecko) 43.

Skúška absorpcie polyetylénglykolu

Účastníci dostali 100 ml testovacieho roztoku PEG s molekulovou hmotnosťou 1 mg (Mr) 400 (PEG6-PEG 13; hmotnostné rozpätie: 285-678 Da), 200 mg Mr 1500 (PEG20-PEG 45; hmotnostné): 899-2 000 Da), 4 g Mr 3000 (PEG 51-PEG 90; hmotnostný rozsah: 2 264 3 982 Da) a 4 g Mr 4000 (PEG 75-PEG 115: hmotnostný rozsah: 3 322 až 5 084 Da) (Merck Darmstadt, Nemecko). Päť hodín po požití roztoku na testovanie cukru sa testovací roztok PEG opil a počas nasledujúcich 24 hodín sa odobrali vzorky moču. PEG sa analyzovali kvapalinovou chromatografiou - hmotnostnou spektrometriou, ako je opísané v Lichtenegger a Rychlik 44 .

Biopsia brušného podkožného tukového tkaniva

Abdominálne podkožné tukové tkanivá sa získali aspiráciou ihlou pred a po umelej diéte. Po premytí v tlmivom roztoku Krebs-Ringer sa tukové tkanivo rozdelilo do skúmaviek obsahujúcich sterilizované sklenené zirkónové guľôčky (Carl Roth, Karlsruhe, Nemecko), tlmivý roztok RLT (RNeasy Mini Kit, Qiagen, Hilden, Nemecko) a 1% (objem/objem) ) β-merkaptoetanol (# M3148, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) a potom okamžite zmrazený a skladovaný pri -80 ° C. Pre histológiu tukov sa tukové tkanivo fixovalo v 4% pufrovanom formalíne (pH 7,4) na 24 hodín a nakoniec sa zalialo do parafínu a až do analýzy sa skladovalo pri teplote miestnosti. Veľkosť adipocytov sa určila pomocou softvéru na analýzu obrázkov s otvoreným zdrojom cellprofiler® (http://www.cellprofiler.org/).

Kvantitatívna polymerázová reťazová reakcia

Vzorky stolice

Vzorky stolice sa odobrali priamo do sterilných plastových nádob (1 000 ml; VWR International, Mníchov, Nemecko). Účastníci boli potom požiadaní, aby odobrali plastovú lyžičku z jedného miesta fekálneho materiálu do skúmavky na odber stolice s 8 ml stabilizačného pufra DNA (Stratec Molecular GmbH, Berlín, Nemecko). Vzorky stolice boli potom okamžite zmrazené na -18 ° C až do ďalšej návštevy. Účastníci transportovali zmrazené vzorky stolice do laboratória pomocou chladiacich jednotiek. Nakoniec sa odberové skúmavky okamžite uskladnili pri -80 ° C.

16 Sekvenovanie amplikónu génu pre S-ribozomálnu RNA s vysokou výkonnosťou

Vzorky sa spracovali tak, ako už bolo opísané 48. Stručne, bunky boli lyžované guľôčkami a tepelným spracovaním a metagenomická DNA bola purifikovaná pomocou gDNA kolón (Macherey-Nagel, Düren, Nemecko). Koncentrácie a čistota sa kontrolovali pomocou systému NanoDrop® (Thermo Scientific Waltham, Massachusetts, USA). Oblasť V3/V4 16 génov pre S-ribozomálnu RNA (rRNA) sa amplifikovala z 24 ng DNA pomocou primérov 341 F a 785 R 49 (25 cyklov). Po purifikácii (systém AMPure XP, Beckmann Coulter Biomedical GmbH) a zhromaždení v ekvimolárnych množstvách bolo 16 amplikónov génu 16 S-rRNA v párovanom režime (PE275) s použitím systému MiSeq (Illumina, Inc., San Diego, California, USA). USA) podľa pokynov výrobcu a konečná koncentrácia DNA 10 pM a 15% (v/v) štandardná knižnica PhiX.

Sekvenčná analýza

Nespracované prečítané súbory boli spracované na základe prístupu UPARSE 50 pomocou IMNGS 51. Sekvencie sa testovali na prítomnosť chimér pomocou UCHIME 52 a OTU sa zhlukovali na prahu 97% podobnosti sekvencií. Aby sa zabránilo analýze nesprávnych OTU, boli aspoň v jednej vzorke uložené iba tie s relatívnou frekvenciou> 0,5% celkových sekvencií. Na priradenie taxonomickej klasifikácie sekvenciám predstavujúcim OTU sa použili SILVA (SILVA Incremental Aligner verzia 1.2.11) 53 a klasifikátor RDP (veta 15; 80% istota) 54. Špecifické OTU s rôznymi frekvenciami medzi skupinami sa ďalej identifikovali pomocou EzTaxonu. Fylogenetické vzťahy sa skúmali pomocou zovšeobecnenej metódy UniFrac 55. Shannonove efektívne počty sa použili na odhad intra-vzorkovej diverzity (alfa diverzita), ako je opísané v Jost et al. 56 .

Štatistická analýza

Dáta boli analyzované v programovacom prostredí R. Antropometrické a metabolické údaje sú uvedené ako priemer ± štandardná odchýlka. Použité hodnoty P 57. Účinok VLCD na OTU a taxonomické sčítania ľudu bol testovaný pomocou Friedmanovho Rankovho testu na analýzu neparametrického randomizovaného bloku. Chýbajúce hodnoty boli liečené Skillings Mackovým testom. Na párové porovnanie sa použil Wilcoxonov podpisový súhrnný test párovania párov. Po niekoľkých testoch bola na nastavenie použitá metóda Benjamini-Hochberg. Pre analýzu diverzity beta boli zovšeobecnené vzdialenosti UniFrac vypočítané s balíkom GUniFrac 55.

vďakyvzdania

Ďakujeme Dr. Claudia Eichhorn za vykonanie aspirácie ihlou, Julius Honecker za vynikajúcu podporu pri meraní veľkosti tukových buniek, Dr. Karin Norman za podporu pri meraní priepustnosti čriev, Manuela Hubersberger za vynikajúcu technickú podporu a Caroline Ziegler ako Angela Sachsenhauser z mikrobiómu/zariadenia NGI ZIEL Core Facility za vynikajúcu podporu pri príprave vzoriek pre vysoko výkonné sekvenovanie. Táto štúdia bola financovaná z BMBF (Federálne ministerstvo školstva a výskumu, grant č. 0315674). Receptovú diétu láskavo poskytla spoločnosť Nutrition Santé SAS (Revel, Francúzsko).

Dodatočný elektronický materiál

Doplnkový spis

Poznámky

Odoslaním komentára vyjadrujete súhlas s našimi podmienkami používania a pokynmi pre komunitu. Ak zistíte, že niečo zneužíva alebo nie je v súlade s našimi podmienkami alebo pokynmi, označte to ako nevhodné.