Vplyv sedimentácie zinku a lipidov na 3, 2-enoyl-CoA izomerázu a vybrané charakteristiky

1 Vplyv sedimentácie zinku a lipidov na 3, 2-enoyl-CoA izomerázu a vybrané vlastnosti lipidového metabolizmu rastúcich potkanov Jennifer Justus Inauguračná dizertačná práca na získanie doktorátu (Dr. oec. Troph.) Na Fakulte poľnohospodárskych vied, ekotrofológie a environmentálneho manažmentu Justus- Liebig University Giessen

2-enoyl-coa

3 Z Ústavu výživy zvierat a fyziológie výživy Univerzity Justusa Liebiga v Gießene Vplyv zinku a lipidovej sedimentácie na Δ3, Δ2-enoyl-CoA izomerázu a vybrané charakteristiky metabolizmu lipidov rastúcich potkanov Inauguračná dizertačná práca na získanie doktorského titulu (Dr. oec . troph.) na fakulte 09 - Poľnohospodárske vedy, ekotrofológia a environmentálny manažment na Justus Liebig University Giessen predložil Dipl. oec. trofej. Jennifer Justus Giessen 2007

4 Dizertačná práca na Fakulte poľnohospodárskych vied, výživových vied a manažmentu životného prostredia na Univerzite Justusa Liebiga v Gießene Dekan: Prof. Dr. Skúšobná komisia R. Herrmanna: Predseda: Prof. Dr. I. Hoffmann prvý recenzent: Prof. Dr. E. Weigand 2. recenzent: Prof. Dr. Skúšajúci J. Pallauf: Prof. Dr. Skúšajúci H. Brückner: PD Dr. Deň sporu S. Rudloffa: 22. januára 2007

5 Obsah I Obsah Zoznam obrázkov. IV Zoznam prehľadov. V Zoznam prílohových tabuliek a obrázkov. VII Zoznam skratiek. IX 1 Úvod Nedostatok zinku a jeho vplyv na metabolizmus lipidov Stopový prvok zinok Nedostatok zinku Biologické funkcie zinku Metabolizmus zinku a stanovenie stavu zinku Regulácia génovej expresie zinkom Zmeny metabolizmu lipidov a špecifický metabolizmus nenasýtených mastných kyselín Zmeny metabolizmu lipidov pri deficite zinku Degradácia nenasýtených mastných kyselín a funkcia Δ 3, Δ 2 -Enoyl-CoA izomeráza Expresný-modulačný potenciál nenasýtených mastných kyselín Experimentálna časť Otázka Popis experimentu Zloženie experimentálneho stravovania Získanie a spracovanie analytického materiálu Analytické metódy Hemoglobín, hematokrit Obsah tuku vo výkaloch Stanovenie stavu zinku Koncentrácia proteínov Aktivita produkcie Δ3, Δ2-enoyl-CoA izomerázy Izolácia mitochondriálnych frakcií A3, A2 -enoyl-CoA izomerázová skúška sukcinátdehydrogenázová analýza génová expresná analýza extrakcia celkovej RNA. 37

6 II Obsah RT-PCR elektroforéza na agarózovom géli a hodnotenie optických denzít Lipidový profil Plazmové lipidy Lipidový profil pečene Vzor mastných kyselín lipidových frakcií pečene Ketónové telieska v plazme a moči Štatistické vyhodnotenie výsledkov experimentu Príjem krmiva, vývoj živej hmotnosti, premena krmiva a stráviteľnosť tuku Stav zinku a hematologické parametre Aktivita Δ 3, Δ 2 -enoyl-CoA izomeráza mrna - expresia Δ3, Δ2 -enoyl-CoA izomerázy a PPARs alfa a gama lipidové lipidové frakcie vzoriek pečeňových mastných kyselín pečeňových lipidových frakcií ketónové telieska Diskusia Komentár k zvieraciemu modelu Vplyv prísunu potravného lipidu a zinku Rast a stav zinku testovaných zvierat Vplyv sedimentácie zinku a lipidov na aktivitu a expresiu A3, A2 -enoyl-CoA izomerázy Vplyv expresie PPARalfa, PPARgammy a ketónovej koncentrácie tela Účinky na lipidový profil plazmy a pečene Vplyv zinku - a sedimentácia lipidov na vzorke mastných kyselín celkových lipidov, triglyceridov a fosfolipidov v pečeni Záver Zhrnutie Bibliografia Príloha. 106

7 Obsah III Zhrnutie Abstrakt Vysvetlenie. 136

10 VI Obsah Prehľad 23: Prehľad 24: Prehľad 25: Prehľad 26: Prehľad 27: Relatívny celkový obsah lipidov, cholesterolu, triglyceridov a fosfolipidov v pečeni (mg/100 g živej hmotnosti). 59 mastných kyselín z celkových lipidov pečene (g/100 g celkových mastných kyselín). 61 mastných kyselín celkových pečeňových lipidov (mg/g pečene FM). 64 mastných kyselín hepatálnej triglyceridovej frakcie (g/100 g celkových mastných kyselín). 66 mastných kyselín pečeňovej fosfolipidovej frakcie (g/100 g celkových mastných kyselín). 67

12 VIII Obsah Obsah Tabuľka A 23: Tabuľka A 24: Koncentrácie 3-hydroxybutyrátu v plazme a v moči zberného obdobia FS metylester v zmesi FAME C4-C24 (18919, Sigma) Tabuľka A 25: Údaje LCQ Obrázok A 1: Molekulárna štruktúra a molekulová hmotnosť trans-3-hexenoyl-coa Obrázok A 2: Hmotnostné spektrá prečisteného trans-3-hexenoyl-coa, pozitívny režim hore, negatívny režim dole Obrázok A 3: Protokol súpravy do auta 3-HB (Wako Chemicals). 132

13 Obsah IX Zoznam skratiek 3-HB 3-Hydroxybutyrát AI Adekvátny príjem ALA Kyselina alfa-linolénová AP Alkalická fosfatáza BHT Butylhydroxyltoluén BSA Hovädzí sérový albumín Chol Cholesterol CoA Koenzým A CRIP Črevný proteín bohatý na cysteín d DIPIP 2,6-dichlórfenol 1 (tiež Nramp2) DEPC dietylpyrokarbonát Kyselina DHA dokosahexaenová DRI Diétny referenčný príjem DTNB 5,5-Ditiobis (kyselina 2-nitrobenzoová) ECI Δ 3, Δ 2 -enoyl-CoA izomeráza EPA Eikosapentaénová kyselina f faktor zriedenia FAME mastná kyselina metylester FID čerstvá hmotnosť -3-fosfátdehydrogenáza GC plynová chromatografia GFS nasýtené mastné kyseliny (strava kakaového masla) GL celkové lipidy Hb hemoglobín Hk hematokrit HNF-4 pečeňový jadrový faktor-4 hzip4 ľudský zrt-, irt-podobný proteín 4 hztl1 ľudský transportér podobný ZnT 1 ICP-AES Spektrometer s indukčne viazaným plazmovým atómovým emisím IS Interný štandard LM Rozpúšťadlo M. Priemer

14 X Obsah MFE1 Multifunkčný enzým 1 minúta minúta MRE Element kovovej odpovede MT Metalotioneín MTF1 MRE viažuci transkripčný faktor-1 MUFS polynenasýtená mastná kyselina n.n. nezistiteľné, množstvo pod detekčným limitom n nie je významné p Pravdepodobnosť chyby PC fosfatidylcholín PCR polymerázová reťazová reakcia PL fosfolipid PP peroxizómový proliferátor PPAR peroxizómový proliferátor aktivovaný receptor PPRE PPAR prvok odpovede RDA Odporúčaná denná dávka RT reverzná transkriptáza RXR SDHrogen štandardná odchýlka X receptor SREBP-1 Sterol Regulačný prvok Väzba Proteín-1 T a TAE TG T m TM TMSH Teplota žíhania Tris-acetát-EDTA pufor Triglycerid Teplota topenia Sušina N-trimetylsulfónium hydroxid U Aktivita enzýmu (jednotka, premena substrátu v μmol min -1) UFS Nenasýtené Mastné kyseliny (potrava pre saflorový olej) UL tolerovateľná úroveň horného príjmu v objeme, porovnanie oproti hmotnosti w Zn zinok ZnT-1 transportér zinku-1

19 Prehľad literatúry 5 ligandov viazaných: na tri aminokyseliny (His, Glu, Asp alebo Cys) a molekulu vody. Zinok je fixovaný tromi His v karboanhydráze a His-Glu-His v karboxypeptidáze (VALLEE a AULD 1990, MCCALL et al. 2000); neprítomnosť zinku vedie k strate katalytickej aktivity. Ako štruktúrna zložka je zinok tetraedricky viazaný na štyri aminokyseliny (Cys alebo His) a ovplyvňuje miestnu konformáciu a stabilitu enzýmu (obrázok 1 A). AB Obrázok 1: Zinkové štruktúry (A) v metaloenzýmoch zinku, (B) vo väzbových doménach DNA transkripčných faktorov (podľa VALLEE a AULD 1992) Zinok tiež určuje trojrozmernú štruktúru zinkových prstov, klastrov zinku a proteínov rotácie zinku, skupinu transkripčných faktorov obsahujúcich zinok ( Obrázok 1 B). Proteíny so zinkovým prstom patria medzi najbežnejšie proteíny v eukaryotickom genóme, ktoré vďaka svojej trojrozmernej konformácii môžu interagovať priamo s DNA. Niektoré z ich rozmanitých funkcií v transkripčnej regulácii sú stále objasnené (LAITY et al. 2001). Cys 2 His 2 a Cys 3 His zinkové prsty môžu tiež rozpoznávať špecifické sekvencie RNA pomocou rôznych mechanizmov a viazať sa na ne (HALL 2005).

24 10 Prehľad literatúry 2.2 Regulácia génovej expresie zinkom Ako katalytická, tak štrukturálna, ako aj regulačná funkcia zinku súvisia s vplyvom na génovú expresiu (prehľad VALLEE a FALCHUK 1993, COUSINS 1998, DREOSTI 2001). Ako podstatný krok transkripcie prebieha syntéza RNA prostredníctvom katalytickej aktivity RNA polymeráz, ktoré ako metaloenzýmy vyžadujú dva atómy zinku. Dôležitosť štruktúrnej funkcie zinku najimpozantnejšie demonštrujú motívy zinkových prstov: Štruktúra prsta v tvare slučky sa vytvorí, keď je atóm zinku tetraedricky komplexovaný s cysteinylovými alebo histidylovými zvyškami peptidového reťazca (obrázok 1 B). Je to nevyhnutný predpoklad pre interakciu s DNA. Podľa nových výpočtov predstavuje 10% ľudského proteómu potenciálne proteíny viažuce zinok (ANDREINI et al. 2006), z ktorých najpočetnejšou triedou sú zinkové prsty, z ktorých väčšina funguje ako transkripčné faktory. Gény reagujúce na zinok fyziologická modulácia priama regulácia sekundárne mediátory regulovaná transkripcia regulované transkripčné proteíny mrnas Obrázok 3: Možné úrovne vplyvu zinku na génovú expresiu (po COUSINS 1998)

58 44 Experimentálna časť, Prehľad 14: Parametre GC a teplotné programy na určenie vzoru FS Detekcia: FID palivové plyny: H 2 (35 ccm/min) syntetický vzduch (250 ccm/min) doplnkový plyn N 2 (25 ccm/min) Autosampler: Chrompack Type 910 Injection: Split Volume: 1 µl Inlay: Glass bell bottom Nosný plyn: H 2 celkové lipidové extrakty: Splitflow: 25 ccm/min Predtlak nosného plynu: 80 kpa Teplotný program: 200 C, 2 C/min na 220 C 220 C 45 minimálny triglyceridový eluát: delený prietok: 20 ccm/min predtlak nosného plynu: 60 kpa teplotný program: 220 C 23 min 2 C/min pri 230 C 230 C 35 min fosfolipidový eluát: delený prietok: 15 ccm/min predtlak nosného plynu: 55 kpa Teplotný program: 220 C 20 min 4 C/min až 235 C 235 C 25 min

59 Experimentálna časť 45 Miera výťažnosti štandardu FAME sa pravidelne kontrolovala (po 2 až 3 vzorkách) a na vyhodnotenie sa použili najmenej tri cykly GC na vzorku. Piky, ktoré nebolo možné priradiť k žiadnemu FS, neboli zahrnuté do analýzy. Medza kvantifikácie, v závislosti od jednotlivej FA a obsahu lipidov v extrakte, bola 0,05% až 0,2% (hmotn./hmotn.) Z celkových mastných kyselín. Chromatogram štandardu FAME je uvedený na obrázku 7. Úplné názvy obsiahnutých FAME sú uvedené v prílohe. Obrázok 7: GC chromatogram ketónových teliesok FAME-Mix C4-C v plazme a moči Koncentrácia 3-hydroxybutyrátu (3-HB) v plazme a moči bola stanovená pomocou autokitu 3-HB (Wako Chemicals). Protokol o stanovení je uvedený v prílohe. Použilo sa 8 ul plazmy alebo 20 ul moču a na stanovenie slepej hodnoty aqua bidest. 3-HB štandard (Ketone Body Calibrator 300) sa zriedil podľa objemu vzorky. Koncentrácie 3-HB v plazme a moči sa stanovili dvojmo u piatich zvierat na skupinu.