Využitie orofaryngeálneho intratracheálneho podávania PAMP a bronchoalveolárna laváž do

Zhrnutie

Imunitná odpoveď hostiteľa na infekciu patogénmi je prísne regulovaný proces. Pomocou modelu expozície lipopolysacharidom v pľúcach u myší je možné vykonať vyhodnotenie komplexných mechanizmov spojených s vývojom ochorenia vo vysokom rozlíšení.

Abstrakt

Úvod

Popísané protokoly sú veľmi flexibilné a dajú sa ľahko modifikovať, aby sa vyhodnotilo široké spektrum PAMP a súvisiace poškodenie molekulárnych vzorov (oslabené). Okrem toho, s niekoľkými ďalšími modifikáciami, je možné tieto protokoly použiť aj na štúdie, ktoré ukazujú progresiu alergického respiračného ochorenia alebo interakcie hostiteľ-patogén so živými baktériami, vírusmi alebo hubami 5-10.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

Celý výskum sa uskutočňoval so súhlasom Výboru pre inštitucionálnu starostlivosť a použitie (IACUC) pre spoločnosť Virginia Tech a v súlade s Sprievodcom národnými inštitútmi zdravia pre starostlivosť a použitie laboratórnych zvierat.

1. Intratracheálna (-é) inokulácia LPS s orofaryngeálnym podaním

2. Odber séra a bronchoalveolárneho výplachu (BAL)

900 μl do priedušnice, nafúknutie pľúc a okamžité odobratie HBSS. Vložte zadný BALF do 15 ml kónickej skúmavky.

  • Tento výplach opakujte ešte dvakrát, aby ste zhromaždili približne 3 ml BALFU pre ďalšiu analýzu. Uchovávajte BALFE na ľade alebo pri teplote 4 ° C až do použitia.

    • 3. Príprava histopatológie

    1. Celú krv odobratú v kroku 2.5 centrifugujte pri 12 000 xg počas 5 minút, aby ste izolovali sérum. Sérum vo vopred označenej 1,5 ml mikrocentrifugačnej skúmavke a uchovávané pri -80 ° C
    2. Hladiny sérových cytokínov sa stanovia pomocou ELISA alebo podobného testu. Zrieďte sérum od 1,05 do 1,20 vo vhodnom riediacom pufri v závislosti od testu podľa pokynov výrobcu. Tieto zriedenia by sa mali stanoviť empiricky pred odobratím väčšiny vzoriek.
    3. Kvôli malému objemu získaného séra znížte objem vzorky na doštičke ELISA s polovičným obsahom. Napríklad väčšina komerčných testov ELISA používa 100 ul objemov štandardov a vzoriek. Na uloženie vzoriek nalejte do každej jamky 50 μl štandardov a zriedeného séra.
    4. Centrifugujte BALF v chladenej stolnej centrifúge pri 200 g po dobu 5 minút. Bezbunkový supernatant preneste do dvoch vopred označených 1,5 ml mikrocentrifugačných skúmaviek a uchovávajte pri -80 ° C.
    5. Vyhodnoťte BALF cytokíny pomocou ELISA alebo podobného testu bez riedenia.
    6. Nepoužívané sérum a BALF pri -80 ° C

    5. Diferenciálne farbenie a hodnotenie bunkovosti BAL

    6. Histopatologické hodnotenie

    1. Pripravte pľúca na histopatologické hodnotenie. Po 24 až 48 hodinách fixácie formalínu sa celé nafúknuté pľúca ventrálne orientujú a zaliaty v parafíne. Vystrihnite bloky, aby ste odhalili výsledné cesty hlavného prúdu.
    2. Na zlepšenie presnosti bodovania umiestnite pľúca do rovnakej polohy a upravte každý blok, čo vedie k maximálnej pozdĺžnej vizualizácii hlavných intrapulmonálnych axiálnych dýchacích ciest. Od tohto bodu nastrihajte 5 mikrónov sériových rezov a zafarbte ich hematoxylínom a eozínom (H&E). Ďalšie rezy je možné narezať a pripraviť na hybridizáciu in situ pomocou štandardných protokolov.
    3. Vyhodnoťte histopatológiu pomocou semikvantitatívneho hodnotiaceho systému založeného na nasledujúcich zápalových parametroch, ktoré sú hodnotené medzi 0 (neprítomné) a 3 (závažné): infiltrácia mononukleárnych a polymorfonukleárnych buniek; Hyperplázia a poranenie buniek epiteliálnych buniek dýchacích ciest; Extravazácia; perivaskulárne a peribroncheolárne tyče; a percento pľúc zapojených do zápalu. Histopatológiu pľúc by mal hodnotiť skúsený patológ.
    4. Spriemerujte všetky hodnoty parametrov, aby ste vytvorili celkové histopatologické skóre, alebo použite jednotlivé skóre na kvantifikáciu špecifických aspektov progresie ochorenia. Všetko bodujte dvojito slepým spôsobom, pričom kontrolóri boli zaslepení tak voči genotypu, ako aj voči liečbe. Bodovací systém bol predtým opísaný 6,7,10.

    Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

    Reprezentatívne výsledky

    Podávanie LPS indukuje vysoké hladiny lokálnych a systémových prozápalových mediátorov, vrátane niekoľkých cytokínov súvisiacich s vrodenou imunitnou odpoveďou. Miestne hladiny cytokínov v BALF sa hodnotia pomocou konvenčných techník, ako je ELISA. Medzi bežné cytokíny, ktoré sú po podaní LPS up-regulované v pľúcach, patria TNF-a, IL-1β a IL-6. (Obr. 2A). Systémové hladiny cytokínov v sére použitím rovnakej techniky ako odhady BALF (2 B) popísané, posúdené. Nie je nezvyčajné, že niektoré mediátory sú prítomné v lokálnom mikroprostredí, ale sú prítomné v sére. Napríklad TNF-a sa bežne vyskytuje vo vysokých hladinách v pľúcach po LPS, ale za podmienok opísaných v tomto protokole sa zvyčajne systémovo nedeteguje. (Obr. 2A a 2 B; pod detekčným limitom).

    využitie
    2. Expozícia dýchacích ciest LPS vedie k zvýšeným hladinám lokálnych a systémových cytokínov. A) Po expozícii LPS možno v BALF pozorovať lokálne hladiny širokého rozsahu prozápalových cytokínov počas prvých 24 hodín, vrátane TNF-a, IL-1β a IL-6. Tieto cytokíny je možné vyhodnotiť pomocou ELISA, ako je tu uvedené, 24 hodín po expozícii LPS. B) V sére sa dá systémovo zistiť aj niekoľko cytokínov. Existuje však niekoľko výnimiek, vrátane TNF-a, ktoré sa nachádzajú v BALF vo vysokých koncentráciách v sére, ale nie sú. Cytokíny, ktoré sú predmetom záujmu v sére, by sa mali hodnotiť empiricky pred hodnotením vo veľkom meradle. Kliknite sem pre väčšie zobrazenie .

    Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

    Diskusia

    Kľúčové kroky pre úspešné vyhodnotenie imunitnej odpovede v myších pľúcach sú nasledujúce: 1) vyberte vhodný kmeň a pohlavie myši pre hodnotený model; 2) optimalizácia dodávania PAMP do pľúc; 3) správne zhromaždiť a spracovať BALF; a 4) správne fixovať a pripraviť pľúca na histopatologické vyšetrenia.

    Zistilo sa, že orofaryngeálne podávanie je presnejšie ako iné formy podávania liečiva do pľúc 2. Je to z veľkej časti spôsobené priamym prístupom do dýchacích ciest a obchádzaním problémov spojených s nazálnym a maxilárnym ukladaním. Rovnako ako pri všetkých testoch na zvieratách si však na získanie vedomostí o manažmente vyžaduje rozsiahlu manuálnu zručnosť a prax. Nesprávna technika môže viesť k neúčinnosti pľúc a v niektorých prípadoch k zraneniu zvierat. Evans Blue Dye (EBD) sa zvyčajne dá efektívne použiť buď ako školiaci nástroj pre tento postup, alebo na riešenie možných problémov spojených s vkladom 4. EBV sa môže podávať a potom extrahovať z tkaniva pomocou formamidu. Množstvo EBD je možné vypočítať pomocou úrovní absorbancie v porovnaní so štandardnou krivkou. V našich rukách sa typické zotavenie EBD pohybuje medzi 90 - 98%. Väčšina z neabsorbovaného farbiva je údajne spojená s únikom do pažeráka. Vďaka svojej presnosti je technológia správy IT ideálna na dodávanie rôznych látok citlivých na dávku do pľúc, napríklad aktívnych farmaceutických zložiek alebo infekčných organizmov.

    t "> Tento postup je optimalizovaný na dodávanie LPS a iných PAMP do pľúc myší. Po zvládnutí týchto techník je možné spustiť ďalšie vyšetrenia tiež pomocou upravených protokolov na efektívne vyhodnotenie interakcií hostiteľ-patogén so živými patogénmi. Rovnako ako tie tu Popísané techniky sú veľmi všestranné a dajú sa použiť v akomkoľvek študijnom záujme pri hodnotení klinického a fyziologického významu experimentálneho alebo farmaceutického činidla. Z dôvodu presnosti dávkovania je táto technika ideálna aj na výskumy in vivo, ktoré si vyžadujú vysoké hladiny. Presnosť financovania.

    Tento postup je optimalizovaný na dodávanie LPS a iných PAMP do pľúc myší. Po zvládnutí týchto techník je možné spustiť aj ďalšie štúdie využívajúce upravené protokoly na efektívne hodnotenie interakcií hostiteľ-patogén so živými patogénmi. Rovnako sú tu opísané techniky veľmi univerzálne a je možné ich použiť pri akejkoľvek štúdii, ktorá sa zaujíma o hodnotenie klinickej a fyziologickej relevantnosti experimentálneho alebo farmaceutického činidla. Kvôli presnosti dávkovania je táto technika potrebná aj pre štúdie in vivo, ktoré si vyžadujú vysoký stupeň presnosti dodávania účinných látok.

    Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

    Zverejnenie

    Autori tvrdia, že neexistujú žiadne konkurenčné finančné záujmy.