Využitie prenosu energie fluorescenčnej rezonancie na štúdium dynamiky proteínových komplexov pri

Zhrnutie

Interakcie bielkovín a proteínov sú pre biologické systémy rozhodujúce a štúdie kinetiky väzby poskytujú náhľad na dynamiku a funkciu proteínových komplexov. Popisujeme metódu, ktorá kvantifikuje kinetické parametre proteínového komplexu pomocou prenosu fluorescenčnej rezonančnej energie a techniky zastaveného toku.

Abstrakt

Úvod

Biologická aktivita sa nakoniec uskutočňuje pomocou proteínov, z ktorých väčšina interaguje s ostatnými kvôli zabezpečeniu správnych biologických funkcií. Pri použití výpočtového prístupu sa predpokladá, že celkové množstvo interakcií proteín-proteín bude u človeka 650 000

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

1. Stiahnite si súbor štruktúry komplexného Cul1 • Cand1 z Protein Data Bank (súbor 1U6G).
2. Ukážte štruktúru komplexu v PyMOL Cul1 • Cand1.
3. Funkcia merania v menu " Asistenti „od spoločnosti PyMOL odhadnúť vzdialenosť medzi prvou aminokyselinou Cand1 a poslednou aminokyselinou Cul1 (obrázok 1).
4. Stiahnite si prehliadač online spektier (pozri Tabuľka materiálov) a zobrazte excitačné a emisné spektrá 7-amino-4-metylkumarínu (AMC) a súčasne blikajte (obrázok 2)). Upozorňujeme, že AMC je donor pražcov a Blitz prijímač pražcov.

Obrázok 1: Kryštalická štruktúra Cul1 • Cand1 a meranie vzdialenosti medzi potenciálnymi značkovacími miestami. Súbor kryštalickej štruktúry bol stiahnutý z Protein Data Bank (súbor 1U6G) a zobrazený v PyMOL. Merania medzi vybranými atómami sa uskutočňovali pomocou PyMOL. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Obrázok 2: excitačné a emisné spektrum fluorescenčných farbív pre Bund. Zobrazujú sa spektrá AMC (7-amino-4-metylkumarín) a FlAsH. Prerušované čiary ukazujú excitačné spektrá a plné čiary emisné spektrá. Obrázok bol pôvodne vytvorený fluorescenčným spektromérom SpectraViewer a bol upravený kvôli lepšej prehľadnosti. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

2. Príprava darcovského proteínu Cul1 AMC • Rbx1, FRET

1. Zostrojte plazmidy na expresiu humánnej Cul1 sortázy • Rbx1 v bunkách E. Coli. Všimnite si, že dva plazmidy Co exprimujúce ľudský Cul1 • Rbx1 v bunkách E. Coli sú podrobne opísané v skoršej správe 20.
   1. Pridajte sekvenciu DNA kódujúcu "LPETGGHHHHHH" (Sortase, seine6 dní) na 3 'koniec sekvencie kódujúcej Cul1 štandardnou PCR a klonovacími metódami 21, 22 .
   2. Sekvencia nového plazmidu na potvrdenie správnosti inzertu génu.
2. Co Express Cul1 Sortase • Rbx1 v bunkách E. Coli. Metóda je odvodená z predchádzajúcej správy 20.
   1. Zmiešajte 100 ng dvoch plazmidov s BL21 (DE3) chemicky kompetentnými bunkami na spoločnú transformáciu metódou Heat Shock 23. Rastú bunky na LB agarovej platni so 100 ug/ml ampicilínu a 34 ug/ml chloramfenikol pri teplote 37 ° C cez noc.
   2. Naočkujte 50 ml LB kultúry čerstvo transformovanými kolóniami a kultivujte cez noc pri 37 ° C, pretrepávaním 250 otáčkami za minútu. To dáva začiatočnú kultúru.
   3. Naočkujte 6 fliaš, každú s 1 1 LB média s 5 ml štartovacej kultúry, a pestujte pri 37 ° C za pretrepávania 250 otáčok za minútu až do OD600.

      3. Pripravte Flash-Cand1, akceptorový proteín Bund

      Poznámka: Väčšina krokov v tejto časti je rovnaká ako krok 2. Podmienky, ktoré sa líšia, sú podrobne popísané nižšie.

      40 uM prenosom pufru cez membránovú ultrafiltráciu (medzná hodnota 30 kDa). Odhadnite koncentráciu proteínu pomocou absorbancie pri 280 nm. Proteín uložte ako 50 ul alikvóty pri -80 ° C.
      Poznámka: Tu je možné pozastaviť protokol.

3. Vytvorenie Flash Cand1.
   1. Pridajte bleskový roztok 1 µL (pozri Tabuľka materiálov) do 50 ul roztoku TetraCys Cand1.
   2. Dobre premiešajte a zmes inkubujte pri izbovej teplote v tme 1 - 2 hodiny na FlAsH Cand1.
      Poznámka: Tu je možné pozastaviť protokol.

4. Pripravte Cand1, bielkovinu Bund chase

POZNÁMKA: Protokol prípravy proteínu je podobný ako v kroku 3 s nasledujúcimi zmenami.

1. Vložte kódujúcu sekvenciu celej večernej Cand1 do vektora pGEX-4 t-2.
2. Vymeňte pufer použitý v kroku 3.3.5 na pufer obsahujúci 30 mM Tris-HCl, 100 mM NaCI, 1 mM DVB-t, 10% glycerol.
3. Odstráňte kroky 3.3.7 a 3.3.8.

5. Vyskúšajte a potvrďte test Bund

6. Zmerajte spojenie rýchlostnej konštanty (nákupu) Cul1 • Cand1

POZNÁMKA: Podrobnosti o činnosti fluorimetra so zastaveným prietokom boli opísané v predchádzajúcej správe 26.

7. Zmerajte disociačnú rýchlostnú konštantu (koff) Cul1 • Cand1 v prítomnosti Skp1 • F-box proteínu.

Poznámka: Tento krok je podobný kroku 6 s nasledujúcimi zmenami.

1. V injekčnej striekačke A pod touto pozíciou vyplniť, Naplňte roztok 100 nM Cul1 AMC • Rbx1 a 100 nM FlAsH Cand1 do zväzku pufra. Otočte príklad polohy „JAZDU“.
2. Naplňte injekčnú striekačku B pod túto pozíciu vyplniť, riešenie Skp1 • Skp2 (pripravené podľa predchádzajúcej správy 20). Otočte príklad polohy „JAZDU“.
3. Otvor to Ovládací panel pod získať Naprogramujte AMC na zaznamenávanie do softvéru a emisie Cul1 na 30 s. Potom urobte jeden záber. Fluorescenčné signály sa časom zmiešajú po zmiešaní striekačky A a striekačky B (obrázok 5).

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Reprezentatívne výsledky

Obrázok 3: Reprezentatívny test Bund na tvorbu komplexu Cul1 • Cand1. Vzorky vo zväzku tlmivého roztoku (30 mM Tris-HCl, 100 mM NaCI, 0,5 mM DVB-t, 1 mg/ml ovalbumínu, pH 7,6) boli nadšené pri 350 nm a emisie boli skenované od 400 nm do 650 nm. (A) Emisné spektrá 70 nM Cul1 AMC, 70 nM FlAsH Cand1 (plné) a ich zmes (FRET). Cand1 (plná) znamená celú dĺžku Cand1. (B) Emisné spektrá 70 nM Cul1 AMC, 70 nM FlAsH Cand1 a ich zmes (FRET). V tomto experimente a potom bola použitá Cand1 s odstránenou prvou špirálou. (C) Chasové emisné spektrá zo 70 nM Cul1 AMC, 70 nM FlAsH Cand1, zmes oboch (FRET) a kontroly pre Bund (Chase). Vzorka Chase obsahovala 70 nM Cul1 AMC, 700 nM Cand1 a 70 nM FlAsH Cand1. (D) Emisné spektrá 70 nM Cul1 AMC, zmes 70 nM Cul1 AMC a 70 nM FlAsH Cand1 (Bund) a 700 nM Skp1 • Skp2 pridané do 70 nM Cul1 AMC • FlAsH Cand1 komplexu. V každom grafe boli emisné signály normalizované na emisiu 70 nM Cul1 AMC pri 450 nm. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Na meranie nákupu Cul1 • Cand1 pomocou zavedeného testu FRET znížením signálu kódovacieho zariadenia v priebehu času na monitore fluorimetra so zastaveným prietokom sme najskôr testovali a stanovili koncentráciu proteínu, ktorý sa má použiť. Keď sa použilo 5 nM Cul1 AMC a FlAsH Cand1, pozorovala sa veľmi malá zmena signálu (obr. 4A)) zatiaľ čo keď sa koncentrácia každého proteínu zvýšila na 50 nM, pozorovalo sa zníženie signálu v čase (obrázok 4b) a táto zmena bola zrušená, keď pufre neobsahovali FlAsH Cand1 (obrázok 4) bol pridaný. Preto sa pre ďalšiu analýzu použilo 50 nM Cul1 AMC a zmiešaním 50 nM Cul1 AMC so zvyšujúcimi sa koncentráciami FlAsH Cand1 sa meralo množstvo pozorovaných konštantných asociačných rýchlostí (kObs). KOb pre každý experiment sa vypočítali začlenením odkazov na exponenciálnu krivku a kOb získané z rovnakej koncentrácie FlAsH Candl sa spriemerovali. Vyneste priemerné kObs s koncentráciou Cand1 a lineárnou regresiou (obrázok 4) vykonať, nákup bol určený 7,27 .

Obrázok 4: Reprezentatívne meranie rýchlostnej konštanty klubu. (A) fluorescencia 5 nM Cul1 AMC sa monitorovala fluorimetrom so zastaveným prietokom v priebehu času po pridaní 5 nM FlAsH Cand1. (B) fluorescencia 50 nM Cul1 AMC sa monitorovala fluorimetrom so zastaveným tokom v čase po pridaní 50 nM FlAsH Cand1. (C) fluorescencia 50 nM Cul1 AMC sa monitorovala fluorimetrom so zastaveným prietokom v priebehu času po pridaní Bund tlmivého roztoku. (D) kúpiť za väzbu Cand1 na Cul1. k-Obs z Cul1 • Cand1 pri rôznych koncentráciách Cand1 sú zobrazené. Lineárny sklon dáva nákup 1,8 x 10 7 M -1 s -1. Na zobrazenie chybových pruhov ± SEM; n = 4. Všetky vzorky sa pripravili v hromadnom pufri a excitovali sa pri 350 nm. Na zber signálov z AMC a na vylúčenie bleskových signálov sa použil pásmový filter. Normalizované neboli žiadne údaje. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Podobne ako pri meraní nákupu sme merali rýchlostnú konštantu pozorovanú disociáciu Cul1 • Cand1 monitorovaním zvýšenia (zotavenia) darcovského signálu v priebehu času na fluorimetri so zastaveným prietokom. Najskôr sa zmiešali Cul1 AMC a FlAsH Cand1 a potom sa Skp1 • Skp2 pridal k vopred zostavenému Cul1 AMC • FlAsH Cand1 na fluorimetri so zastaveným prietokom. Signál kódovacieho zariadenia sa rýchlo zvyšuje a odhaľuje kObs 0,4 s -1 (obrázok 5). Naproti tomu, keď sa do vopred zostaveného Cul1 AMC • FlAsH Cand1 pridal tlmivý roztok, nepozorovalo sa žiadne zvýšenie signálu, čo naznačuje rýchlu disociáciu Cul1 • Cand1 vyvolanú Skp1 • Skp2.

Obrázok 5: Reprezentatívne meranie disociačnej rýchlostnej konštanty. Zmena fluorescencie darcu v porovnaní s časom sa merala po pridaní 150 nM Skp1 • Skp2 alebo Bund pufru do 50 nM Cul1 AMC • FlAsH Cand1 komplexu. Zmeny signálu sa prispôsobili exponenciálnej krivke a pozorovala sa konštanta disociačnej rýchlosti 0,4 s -1. Experimentálne podmienky boli podobné podmienkam na obrázku 4popísané. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Diskusia

Pretože pražce sú citlivé a kvantitatívne, stali sa dôležitým nástrojom na štúdium interakcie medzi makromolekulami. Tento protokol poskytuje príklad použitia pražca na štúdium dynamiky proteínového komplexu v roztoku. Bund sa tiež použil spolu so zobrazovaním živých buniek na štúdium molekulárnych interakcií v živých bunkách 36, ktoré je účinné pri odhaľovaní dynamiky proteínových komplexov za fyziologických podmienok. Okrem toho sa pražce môžu použiť aj na úrovni jednej molekuly, študovať dynamiku makromolekulárnych komplexov 37, 38 v reálnom čase a študovať pohľady na konformačné zmeny komplexu. Na zlepšenie účinnosti a detekcie pražcov sú veľmi zaujímavé fluorofory a biosenzory s jasom a fotostabilitou, ktoré sa aktívne vyvíjajú a študujú 28, 39 .

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

---