Vývoj paralelnej viaczložkovej analýzy reakcií antigén-protilátka v USA

Vývoj paralelnej viaczložkovej analýzy reakcií antigén-protilátka v dopingovej analýze Dizertačná práca na získanie akademického titulu „doctor rerum naturalium“ (Dr. rer. Nat.) Vo vedeckej disciplíne biochémie predloženej na Matematicko-prírodovedeckej fakulte Postupimskej univerzity Kai Wunderlich Potsdam, 29. septembra 2014

analýzy

Toto dielo je licencované na základe licenčnej zmluvy Creative Commons: Uvedenie zdroja Žiadne komerčné použitie Žiadne odvodené dielo 4.0 Medzinárodné Ak chcete zobraziť podmienky licencie, použite hypertextový odkaz: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ Online zverejnené na publikačnom serveri univerzity v Postupime: URN urn: nbn: de: kobv: 517-opus4-76869 http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-76869

Život je ako na bicykli. Musíte ísť vpred, aby ste nestratili rovnováhu. Albert Einstein

Obsah Zoznam tabuliek Zoznam obrázkov V VII 1. Motivácia 1 1.1. Doping v sociálnom a športovom kontexte. 1 1.2. Dopingové zákazy a potreba dopingových kontrol 5 1.3. Možnosti a perspektívy testov dopingových kontrol v mieste starostlivosti. 7 2. Základné informácie 9 2.1. Pojem doping a klasifikácia tried látok v zozname zakázaných látok WADA. 9 2.2. Analytické metódy na zisťovanie dopingových látok. 12 2.2.1. Plynová chromatografia/hmotnostná spektrometria ako zavedená analytická metóda pre dopingovú analýzu. 13 2.2.2. Metódy detekcie založené na imunoanalýze na detekciu peptidových hormónov a rastových faktorov 15 2.2.3. Ako fungujú protilátky a ich úloha v imunotestoch. 16 2.3. Peptidové hormóny ako kandidáti na vývoj multiparametrického dopingového testu. 19 2.3.1. Luteinizačný hormón (LH) a jeho úloha ako dopingového činidla. 20 2.3.2. Ľudský choriový gonadotropín (hcg-i) a jeho úloha ako dopingového činidla. 23 2.3.3. Varianty týchto peptidových hormónov a farmakologické limitné hodnoty. 24 2.4. Technická koncepcia. 25 I.

4.3. Microarray experimenty na stanovenie krížovej reaktivity. 60 4.3.1. Microarray experimenty so súčasným použitím rôznych detekčných protilátok na referenčnom materiáli. 63 4.4. Určte limit kvantifikácie peptidových hormónov na microarray. 67 4.4.1. Séria koncentrácií hcg-intaktného v 1 x PBS tlmivom roztoku 67 4.4.2. Koncentračné série hcg-p v 1 x PBS pufri. 68 4.4.3. Séria koncentrácií LH v 1 x PBS pufri. 69 4.5. Meranie skutočných vzoriek na skle a polymérových podložných sklíčkach 70 4.6. Vykonajte analýzu výkonu s cieľom určiť D-SN a D-SP. 4.6.1.1. Stanovenie diagnostickej citlivosti a špecifickosti LH, hcg-intaktného a hcg-β. 72 4.7. Skúška stability mikročipov pri skladovaní, pokiaľ ide o výsledky merania. 4.7.1. Test stability skladovania počas dvanástich týždňov na zistenie neporušeného HCG. 77 4.7.2. Test stability pri skladovaní počas dvanástich týždňov na detekciu hcg-β. 79 4.7.3. Test stability skladovania počas dvanástich týždňov na detekciu LH. 80 5. Diskusia 83 6. Výhľad 93 7. Zhrnutie 95 Bibliografia 99 A. Príloha 111 A.1. Nárazníky a roztoky. 111 A.1.1. SDS gélová kompozícia na separáciu a zber gélu 113 A.2. Tabuľky. 114 A.3. Publikácie. 126 A.3.1. Recenzované publikácie. 126

A.3.2. Prednášky, plagáty a nerecenzované publikácie. 127 A.4. Pokračovať. 128 A.5. Deň vďakyvzdania. 129 A.6. Čestné vyhlásenie. 130

Zoznam tabuliek 3.1.1 Použité zariadenia. 29 3.1.2 Použitý spotrebný materiál. 30 3.1.3 Použité chemikálie a roztoky. 31 3.1.4 Protilátky. 3.1.5 Peptidové hormóny a materiál vzorky. 33 3.1.6 Použitý softvér. 34 3.2.1 Gélová náplň SDS-PAGE. 36 3.2.2 Nastavenie testu Western blot. 37 3.2.3 Experimentálna schéma, krížová reaktivita na microarray. 42 3.2.4 Klasifikácia výsledkov merania pomocou pravdivostnej matice 48 3.2.5 Veľkosť vzorky na stanovenie reprodukovateľnosti počas dvanástich týždňov. 51 4.1.1. Test krížovej reaktivity monoklonálnych záchytných protilátok. 56 4.1.2. Test krížovej reaktivity polyklonálnych detekčných protilátok. 57 4.2.1.Porovnanie premývacích roztokov na spracovaných mikročipoch. 4.3.1 Test krížovej reaktivity s hcg-i na mikročipoch detekcie a sekundárnych protilátok v 1 x PBS. 4.3.2 Stanovenie účinkov matice a krížových reaktivít v komplexných vzorkách. 65 4.5.1. Meranie skutočných vzoriek na sklenených a polymérnych podložných sklíčkach 71 4.6.1. ROC krivky analýzy výkonu 130 vzoriek séra 73 4.6.2. Analytická interpretácia 130 vzoriek zo slepej dávky 4.6.3 Vyhodnotenie výberového súboru z Ústavu pre biochémiu v Kolíne nad Rýnom. 4.7.1 Test stability úložiska mikročipov pre hcg-i počas dvanástich týždňov. 78 v

4.7.2 Test stability mikročipov pri skladovaní pre hcg-β počas dvanástich týždňov. 4.7.3 Test stability mikročipov pre LH počas dvanástich týždňov 81 A1. Kľúč vzorky pre 130 vzoriek séra na analýzu výkonu. 114 A2. Skúška krížovej reaktivity na mikročipoch detekcie a sekundárnych protilátok pri rôznych koncentráciách hcg-i v 1 x PBS. 118 A3. Skúška krížovej reaktivity na mikročipoch detekcie a sekundárnych protilátok pri rôznych koncentráciách hcg-i v referenčnom materiáli. 119 A4. Skúška krížovej reaktivity na mikročipoch detekcie a sekundárnych protilátok v referenčnom materiáli. 120 A5. Stanovenie účinkov matice a krížových reaktivít v zložitých vzorkách. 121 A6. Vyhodnotenie výberového súboru z Ústavu pre biochémiu v Kolíne nad Rýnom. 122 A7. Test stability mikročipov pre hcg-i počas dvanástich týždňov123 A8. Test stability mikročipov na hcg-β počas dvanástich týždňov. 124 A9. Test stability mikročipov pre LH počas dvanástich týždňov 125

Zoznam obrázkov 2.1. Zoznam zakázaných látok 2013 podľa WADA. 11 2.2. Analýza dopingových vzoriek. 13 2.3. Pracovný diagram. 27 3.1. Bodový vzor mikročipov. 40 4.1. SDS-PAGE na kontrolu koncentrácie proteínu. 54 4.2. Zhrnutie testu krížovej reaktivity microarray na podložných sklíčkach modifikovaných GLYMO. 66 4.3. Séria koncentrácií ľudského chorionického gonadotropínu hcg v 1 x PBS. 67 4.4. Koncentračné série hcg-p v 1 x PBS pufri. 68 4.5. Série koncentrácií LH v 1 x PBS pufri. 69 4.6. Séria koncentrácií LH v plnom sére. 70 VII

2.1. Pojem doping a klasifikácia tried látok v zozname zakázaných látok WADA Obr. 2.1.: Zoznam látok zakázaných podľa WADA 2013 (skrátene). Tu uvedené triedy látok (a príklady) sú zakázané vždy v súťažiach i mimo nich. Peptidové hormóny uvedené v bode S 2.2 (červené políčko): choriový gonadotropín (CG) a luteinizačný hormón (LH) sú zakázané iba u mužov, pretože regulujú kaskádu testosterónu. Oba hormóny sa stanovujú z moču pomocou imunotestov. [WADA, 2012] 11

3. Materiál a experimentálne práce a bioaktivita 14 000 U/mg. To zodpovedá biologickej aktivite 14 000 ul/ul v zásobnom roztoku. P-podjednotka hcg je dostupná ako zásobný roztok s koncentráciou 0,1 mg/ml. Výrobca pre to neuvádza žiadnu bioaktivitu. Podľa [Stenman et al., 2006] sa bioaktivita pre hcg-p uvádza ako 1 U/ug. Zásobný roztok hcg-p podľa toho obsahuje 100 U/ml alebo 100 ul/ul. LH bol prítomný v koncentrácii 0,1 mg/ml. Tabuľka 3.2.3.: Testovacia schéma na detekciu možnej krížovej reaktivity zložiek testu. Ako matrica vzorky sa rovnako testovalo štandardné sérum/krv a kontrolné sérum/krv podľa rovnakej schémy, analogicky s 1 x PBS pufrom. Krížiky znamenajú kombinácie peptidových hormónov a detekčných protilátok. polyklonálne detekčné protilátky proti peptidovému hormónu hcg-α hcg-β LH CRP - - - - x - - - - - x - - - - x - - - - x - - - x - - - 100 mu/ml LH - x - - - - x - - - - x - - - - x - - - 500 mu/ml hcg - x - - - - x - - - x - - - - x - - - 36 mu/ml hcg-β - x - - - - x - - - - x 42