Z lekárskej kliniky so zameraním na hematológiu, onkológiu a imunológiu nádorov - PDF
Z lekárskej kliniky so zameraním na hematológiu, onkológiu a imunológiu nádorov Lekárskej fakulty Charité Universitätsmedizin Berlín DIZERTÁCIA Onkogénom vyvolaná senescencia v sekvencii kolorektálneho adenómu a karcinómu a jej funkcia ako prediktor odpovede na 5-FU v primárne metastatickej situácii na akademický titul Doctor medicinae (Dr. med.) prednesený na Lekárskej fakulte Charité Universitätsmedizin v Berlíne Anjou Haugstetterovou zo Stuttgartu-Bad Cannstattu
Recenzent: 1. Prof. Dr. med. C. A. Schmitt 2. Prof. Dr. med. F. R. Greten 3. Prof. Dr. med. L. Zender Dátum PhD: 18. novembra 2011 2
Obsah 1 Úvod 6 1.1 Kolorektálny adenokarcinóm 6 1.1.1 Epidemiológia kolorektálneho adenokarcinómu 6 1.1.2 Rizikové faktory pre vznik kolorektálneho karcinómu 6 1.1.3 Prognosticky relevantné faktory 7 1.1.4 Sekvencia karcinómu adenómu 8 1.1.5 Onkogénny ras 10 6 Terapia kolorektálneho adenokarcinómu 11 1.2 Apoptóza 11 1.3 Starnutie 12 1.3.1 Vlastnosti starnutia 13 1.3.2 Potenciálne markery starnutia 15 1.3.3 Význam onkogénom indukovanej starnutia in vivo 18 1.3.4 Predčasná starnutie a chemoterapeutiká 19 2 Výskumná otázka 22 3 Materiál a metódy 23 3.1 Materiál 23 3.1.1 Bunkové línie a bakteriálne línie 23 3.1.2 Médiá 23 3.1.3 Roztoky 24 3.1.4 Plazmidy 25 3.1.5 Pomôcky a príslušenstvo 25 3.1.6 Protilátky 27 3
3.2 Metódy 28 3.2.1 Bunková kultúra 29 3.2.1.1 Bunkové línie 29 3.2.1.2 Subkultivácia bunkových línií 30 3.2.1.3 Kryokonzervácia buniek 30 3.2.1.4 Počet buniek, rastové krivky, životaschopnosť 30 3.2.2 Retrovírusová infekcia 31 3.2.2.1 Použité plazmidy 31 3.2. 2.1 Transformácia 31 3.2.2.2 Minipríprava DNA 32 3.2.2.3 Maxipríprava DNA 33 3.2.2.4 Fotometrické stanovenie koncentrácie roztoku DNA 33 3.2.2.5 Elektroforetická separácia fragmentov DNA 34 3.2.2.6 Transdukcia 34 3.2. 2.6.1 Transfekcia sprostredkovaná fosforečnanom vápenatým 34 3.2.2.6.2 Infekcia cieľových buniek 35 3.2.3 Fixácia a zabudovanie parafínu do kontrol 35 3.2.4 Metódy farbenia 37 3.2.4.1 Imunohistochémia 37 3.2.4.2 Fluorescenčné farbenie SAHF 39 3.2.4.3 SA-beta-Gal -Získanie 39 3.2.4.4 Vyhodnotenie farbenia tkaniva 40 3.2.5 Merania prietokovej cytometrie: profil BrdU-PI 40 3.2.6 Výber pacientov a údaje z následného sledovania 41 3.2.7 Stanovenie mutácie onkogénu K-ras 42 3.2.8 Štatistika 42 4
4 Výsledky 43 4.1 Produkcia kontroly starnutia z fibroblastov 43 4.2 Starnutie v kryogénnych tkanivách 47 4.3 Senescencia v parafínových tkanivách 53 4.4 Hodnotenie klinického významu 65 5 Diskusia 73 5.1 Porovnanie so súčasnou literatúrou 74 5.2 Kritické poznámky 80 5.3 Výhľad 81 6 Zhrnutie 83 7 Príloha 85 7.1 Bibliografia 85 7.2 Zoznam obrázkov 95 7.3 Zoznam tabuliek 96 7.4 Zoznam skratiek 97 7.5 Zoznam publikácií 99 8 Poďakovanie 100 9 Životopis 101 10 Čestné vyhlásenie 103 5
Začiatok poškodenia DNA, na ktoré bunka reaguje starnutím, sa premalígny nádor zastaví vo svojom raste. Tkanivo sa môže chrániť pred progresiou do malígneho nádoru. Obrázok 5: Terapia vyvolaná starnutie. Úloha starnutia v premalígnych a malígnych nádoroch. Aktivácia onkogénu v normálnych bunkách vedie k počiatočnej hyperproliferácii. Výsledné poškodenie DNA aktivuje program na potlačenie nádoru, ktorý zastaví rast premalígneho nádoru. Nájdené sú typické znaky starnutia. Ak dôjde k mutácii, ktorá vypne program potlačujúci nádor, alebo alternatívne k zníženiu sprievodných faktorov, ktoré podporujú starnutie, nádor začne znova rásť a vyvíja sa invazívna malignita. Ak je malígny nádor liečený chemoterapeutikami, ak reaguje, vedie to k apoptóze bunkovej samovraždy alebo opäť k starnutiu zástavy terminálneho bunkového cyklu. Čo sa presne stane z molekulárneho biologického hľadiska počas progresie premalígneho nádoru na karcinóm, nie je jasné. Na jednej strane je možná mutácia efektora 20
Iniciácia signálnej cesty senescenčného aparátu, napr. mutáciu p53, s ktorou sa premalígny nádor začína množiť nekontrolovaným invazívnym spôsobom. Alternatívny model považuje starnutie v premalígnej lézii za vyjadrenie onkogénnej aktivity spolu s ďalšími faktormi podporujúcimi starnutie. Medzi tieto faktory môžu patriť bunkové autonómne a prípadne miestne nebunkové autonómne podmienky, ako sú napr. vaskulárna hustota, prítomnosť hypoxie a cytokíny vylučované makrofágmi. Progresia do invazívneho karcinómu sa potom vysvetľuje nižším prospešným tlakom, ktorý umožňuje prekonať OIS. Zásadný rozdiel v tomto modeli spočíva v tom, že bunky zostávajú geneticky schopné starnutia. V malígnom nádore, ktorý sa vytvoril, môže byť stále niekoľko malých starnúcich oblastí. Ak sa niekto teraz lieči chemoterapeutickými látkami, môže sa nádor v prípade starnutia znovu zastaviť alebo prejsť do apoptózy, ak dôjde k reakcii na liečbu. 21. deň
Materiál a metódy 3 Materiál a metódy 3.1 Materiál Laboratórne chemikálie dodali spoločnosti Merck (Nemecko), Biochrom (Nemecko), Sigma (Nemecko), Roth (Nemecko), Serva Electrophoresis (Nemecko), New England Biolabs (Nemecko), DAKO (Dánsko) a Spoločnosť Gibco (USA) má najvyššiu kvalitu. Zariadenia a príslušenstvo, ako aj materiály pre bunkové kultúry boli získané od spoločností Falcon (Nemecko), Eppendorf (Nemecko), Nunc (Nemecko) a Techno Plastic Products (Švajčiarsko) ako sterilné jednorazové predmety. Opätovne použiteľné materiály sa autoklávovali. Chemikálie a materiály od iných výrobcov sú uvedené v nasledujúcom zozname. 3.1.1 Bunkové línie a bakteriálna línia IMR90 American Type Culture Collection (ATCC), USA (CCl-186) adherentné diploidné ľudské pľúcne fibroblasty od 16 týždňov starého plodu Phoenix eco Nolan Lab, USA 135 adherentná ľudská embryonálna obličková bunková línia 293T E. coli (DH5α) Invitrogen, Nemecko 3.1.2 Médium pre kultiváciu buniek (skladujte pri 4 ° C) Dulbeccovo modifikované Eagle médium (DMEM + 4500 mg/l glukóza + L-glutamín + pyruvát) + 10-15% FBS + 100 U/ml zmrazovacie médium penicilín-streptomycín ( skladujte pri 4 ° C) FBS (fetálne teľacie sérum) + 10% DMSO lyzogénny bujón (LB) médium 10 g/l tryptón + 5 g/l NaCl, (možno + ampicilín) 23
Materiál a metódy 3.1.3 Roztoky PBS (soľný roztok pufrovaný fosfátmi) (skladujte pri izbovej teplote) 8 g NaCl (137 mm) + 0,2 g KCl (2,7 mm) + 1,44 g Na2HP04 (10 nm) ) + 0,24 g KH2P04 (2 mm) naplňte do 800 ml dh20; titrujte na pH 7,4 až 1 l, doplňte roztokom dh20 O1 (mini-prípravok) (skladujte pri 4 ° C) 50 mm glukóza + 25 mm Tris-HCl (ph 8,0) + 10 mm EDTA (ph 8, 0) v roztoku dh 2 O P1 (mini prípravok) (skladujte pri 4 ° C) roztok S1 + 100 µl/ml RNázy A, pridajte vždy čerstvý roztok S2 (mini prípravok) (skladujte pri izbovej teplote) 0,2 N NaOH + 1% SDS v dh20 vždy čerstvo pripravte vždy roztok S3 (mini príprava) (skladujte pri 4 ° C) 60 ml 5 M octanu draselného + 11,5 ml kyseliny octovej + 28,5 ml dh20 50 x TAE (skladujte pri RT) 242 g Trisbase + 57,1 ml ľadovej kyseliny octovej + 100 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) SA-beta-Gal-PBS (skladujte pri RT) PBS + 1 mm MgCl2 titrovaný na pH 6 pre ľudské tkanivá SA-beta-Gal fixátor SA-beta-Gal-PBS + 2% paraformaldehyd + 0,25% glutaraldehyd 24
Materiál a metódy Roztok X-Gal SA-beta-Gal-PBS + 1 mg/ml 5-bróm-4-chlór-3-indolyl-ß-D-galaktozid + 50 µl/ml 20 x roztok kyanidu draselného 20 x roztok kyanidu draselného (pri 4 C) 820 mg K 3 Fe (CN) 6 + 1,050 g K 4 Fe (CN) 6 x 3h 2 0 naplňte do 25 ml PBS Mowiol 4-88 (alikvotné množstvá udržujte na -20 ° C, pred použitím predhrejte na 37 ° C) ) Zmiešajte 8 g Mowiol + 40 ml 0,2 M Tris-HCl (pH 8,5) pri 50-60 ° C; Po ochladení: +20 ml glycerolu + 2,5% DABCO QIAamp DNS Mini Kit Quiagen, Nemecko BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit 3130 Genetický analyzátor, Biosystems, USA 3.1.4 Plazmidy Plazmový hlavný reťazec Originál pbabe-ras pbabe-puro H-rasV12 Scott Lowe prázdny pbabe-prázdny pbabe-puro - Scott Lowe 3.1.5 Prístroje a príslušenstvo Biofotometer 8,5 mm Eppendorf, Nemecko Prietokový cytometer (triedenie buniek aktivované fluorescenciou, FACS) FACSCalibur Becton Dickinson, Nemecko Vkladacie zariadenie EG1160 Leica, Nemecko 25
Materiály a metódy Elektroforéza Napájanie E835 Consort, Belgicko Odvodňovacie zariadenie ASP300 Leica, Nemecko Inkubátor Steri-kult 200 Labotect GmbH, Nemecko Invisorb Plasmid Maxikit Invitek, Nemecko Camera Inteq, Nemecko Kryostat FrigoCut 2800 Reicher-Jung, Nemecko Microtom RM2035 Leica, Nemecko Mikroskop Krüss Optronic, Nemecko Mikroskop na fluorescenčné farbenie Zeiss Axioplan Pán mraziaci mraziaci box (1 C za minútu) Vylepšená počítacia komora Nalgene Labware Neubauer Hĺbka 0,1 mm Parafínové kazety Superior Marienfeld, Nemecko Medite, Nemecko Sterilná banka Kendro HeraSafe Heraeus, Nemecko Nádrž na dusík Thermolyne 6Plus Locator Thermo Scientific, Nemecko Thermomixer comfort 1,5 ml Eppendorf, Nemecko Vykurovacia skrinka Function Line Heraeus, Nemecko Odstredivka Eppendorf 5417 R Eppendorf, Nemecko Odstredivka Heraeus Megafuge 1,0 R Heraeus, Nemecko 26
Materiál a metódy 3.1.6 Pôvod antigénu protilátky Spoločnosť štiepila kaspázu 3/Asp175 Rabbit Cell Signaling Technology, USA (# 9661) H3K9me 3 Rabbit Abcam, USA (ab8898) HP1 γ myš Chemicon, USA (MAB3450) Ki67 myš DAKO, Dánsko (M7240) ) P16 myš Novocastra, Veľká Británia (NCL-p16-432) P53 myš onkogén, Nemecko (OP43, AB-6) PAI-1 myš Novocastra, Veľká Británia (Ncl-PAI-1) Phospho-Chk2 (Thr68) králičia bunková signalizačná technológia, USA (# 2661) Phospho-Erk 1/2 (Thr202/Tyr204) Rabbit Cell Signaling Technology, USA (# 4376) Phospho-H2A.x (Ser139) Rabbit Cell Signaling Technology, USA (# 2577) Phospho-P53 (Ser15) Rabbit Cell Signaling Technology, USA (# 9284) PML Mouse DAKO, Dánsko (M7202) Fluorescenčné sekundárne protilátky Anti-Mouse IgG koza GIBCO Invitrogen, Nemecko (Alexa Fluor 594; A21121) Fluorescenčná myš anti-BrdU GIBCO Invitrogen, Nemecko (MD5300) ) Protikráličia druhá protilátka Donkey Dianova, Nemecko LSAB-AP Kit Dako, Dánsko (K0689) LSAB-HRP Kit Dako, Dánsko (K0690) 27
Materiál a metódy 3.2 Metódy Prehľad experimentálneho nastavenia a načasovanie jednotlivých krokov poskytuje Obrázok 6. Obrázok 6: Prehľad metód. Prehľad jednotlivých krokov experimentov. Krok A: Produkcia kontrol pre starnúci fenotyp z fibroblastov IMR90. IMR90 boli retrovírusovo infikované ras alebo prázdnym vektorom. Po skončení selekcie sa kultivácia nechala šesť dní. Počas tejto doby sa prejavil starnúci fenotyp IMR90ras, zatiaľ čo IMR90empty pokračoval v množení. Boli vykonané rôzne testy starnutia, ako sú rastové krivky, test SA-beta-Gal a analýza bunkového cyklu. Infikované bunky sa bleskovo zmrazili ako bunkové pelety buď pre kryokontroly alebo dehydratovali pre parafínové kontroly a zaliali sa do parafínu. Krok B: Kryokontroly IMR90 a kolorektálne kryogénne tkanivá (5 normálnych tkanív, 12 adenómov, 6 karcinómov) sa skúmali na starnutie pomocou testu SA-beta-Gal a imunohistochemickou detekciou Ki67. Krok C: IMR90 parafín 28