2D gélová elektroforéza - biológia
The dvojrozmerná gélová elektroforéza alebo 2D gélová elektroforéza je analytická metóda v biochémii, molekulárnej biológii a proteomike. Vyvinuli ho v roku 1975 nezávisle O'Farrell [1] a Klose [2]. Kombinuje izoelektrickú fokusáciu (IEF) s SDS polyakrylamidovou gélovou elektroforézou (SDS-PAGE) na oddelenie komplexných proteínových zmesí (bakteriálne lyzáty, lyzáty z vyšších buniek alebo tkanív, telesné tekutiny) do jednotlivých proteínov. Zvlášť vysoké rozlíšenie sa dosahuje kombináciou dvoch techník ortogonálneho oddelenia.
Každá škvrna v proteínovom obrazci zodpovedá typu (druhu) proteínových molekúl. Pretože sa bielkovinové vzorce v biologických systémoch menia v závislosti od prostredia a stavu, dajú sa použiť na rozlíšenie medzi poškodenými a zdravými alebo optimálne a neoptimálne pestovanými bunkami. Poskytujú napríklad informácie o príčinách chorôb alebo mechanizme účinku liekov na molekulárnej úrovni. Kvôli zložitosti dvojrozmerných proteínových vzorov sa na ich hodnotenie používajú špeciálne vyvinuté počítačové programy.
príprava vzorky
Vzorka sa získa a spracuje za čo najviac rovnakých podmienok. To vylučuje možnosť, že okrem experimentálnych premenných, ktoré sa majú preskúmať, na vzorku pôsobia aj falošné vplyvy. Proteíny sa väčšinou zrážajú z extracelulárnych biotopov (vylučované proteíny). Intracelulárne proteíny sa extrahujú jemným zničením bunkových štruktúr. Okrem prirodzeného prostredia sú proteíny obzvlášť náchylné na tvorbu agregátov a degradáciu proteázami. Príprava vzorky navyše funguje pri 0 ° C. Spravidla sa pridávajú močovina a neiónové detergenty, ako aj látky inhibujúce proteázu, aby sa zabránilo interakciám a zmenám v proteínoch.
Prvá dimenzia (IEF)
Počas IEF (prvá dimenzia) sa proteínový extrakt oddelí jednorozmerne v gradiente gélu pH v elektrickom poli. Kyslé a zásadité aminokyselinové zvyšky proteínov prechádzajú rôznymi (de) protonačnými stavmi v závislosti od hodnoty pH okolia a určujú tak náboj proteínu. Sú teda zodpovední za vplyv elektrického poľa na proteíny. V izoelektrickom bode (pI) sa kladné a záporné náboje na proteíne navzájom rušia. Pi zodpovedá pH, pri ktorom má proteín čistý náboj nula. Elektrické pole už nepôsobí ako sila na teraz nábojovo neutrálny proteín a proteín sa ukladá. Zmeny polohy v susedných rozsahoch pH spôsobené difúziou vedú k obnovenému elektrickému nabíjaniu proteínu. Znovuúčinné elektrické pole však okamžite podporuje proteín späť do jeho izoelektrického bodu. K dispozícii sú dve rôzne technológie IEF.
- Imobilizované gradienty pH (IPG): Gélový prúžok pozostáva z polyakrylamidovej matrice. Jeden koniec gélového prúžku obsahuje akrylamidové deriváty s kyslými postrannými reťazcami v matrici a deriváty s alkalickými funkčnými skupinami na druhej strane. Kopolymeráciou neutrálneho akrylamidu s kyslými a zásaditými derivátmi pridanými do gradientu sa vytvorí nemenný pH gradient.
- Gradienty pH založené na nosných amfolytoch: Nosné amfolyty sú syntetické aminokyseliny a sú voľne pohyblivé v gélovom páse alebo v dlhom valcovom géle (zvyčajne v skúmavke). Keď sa použije elektrické pole, vytvoria gradient pH, ktorý je však časom nestabilný. S pribúdajúcim časom nosiče náboja definujúce gradient migrujú na konce gélu a skôr alebo neskôr deformujú jeho priebeh.
Rovnováha
Pri takzvanej ekvilibrácii, ktorá nasleduje po separácii po pi, sa gél s proteínmi spočiatku redukuje (napríklad merkaptoetanolom alebo ditiotreitolom). To slúži na odstránenie disulfidových mostov. Aby sa zabránilo reoxidácii výsledných -SH HS skupín na disulfidové (-S-S-) skupiny, v ďalšom kroku sa HS skupiny z. B. alkylovaný jódacetamidom. Nakoniec sú proteíny naplnené dodecylsulfátom sodným (SDS). SDS je záporne nabitý prací prostriedok. Na každé 3 aminokyseliny sa asi jedna molekula SDS viaže na molekulu proteínu prostredníctvom svojho alifatického konca prostredníctvom hydrofóbnej interakcie. So záporne nabitou stranou sa odpudzuje od nabitých koncov v blízkosti viazaných molekúl SDS. To vedie k úplnému rozvinutiu (linearizácii) molekúl proteínu. Čím väčšia je molekula proteínu, tým dlhšie sú výsledné reťazce nabité SDS. Pretože v závislosti na dĺžke proteínu sa viaže veľké množstvo negatívne nabitých molekúl SDS, je možné vnútorný náboj väčšiny proteínov následne zanedbať.
Druhý rozmer (SDS-PAGE)
Gélový prúžok s oddelenými proteínmi a ekvilibrovanými podľa hodnoty pH sa umiestni na okraj štvorcového alebo obdĺžnikového polyakrylamidového gélu, ktorý tiež obsahuje SDS, a proteíny sa teraz separujú podľa veľkosti kolmej na prvý rozmer v druhej elektroforéze. Keď sa použije elektrické pole (anóda oproti gélovému prúžku IEF), rozvinuté proteíny obklopené SDS migrujú s prebytkom negatívnych nábojov cez gél, čo poskytuje proteínom väčšiu alebo menšiu odolnosť podľa ich molekulárnej veľkosti. Malé molekuly migrujú relatívne nerušene a rýchlo sa dostanú k okraju gélu smerom od gélu IEF, zatiaľ čo veľké molekuly gél počas migrácie neustále spomaľuje a takmer nedosahujú žiadny pokrok. Separácia v druhej dimenzii sa zastaví, keď malé proteíny dorazia k okraju gélu smerom od gélu IEF. Toto je viditeľné pomocou pozdĺžneho farbiva, ako je brómfenolová modrá. Aby proteínový profil zostal prítomný aj po separácii, musí sa zafixovať v poslednom kroku. Na to sa používa metanol a kyselina octová. Tieto denaturujú oddelené proteíny a spájajú ich s gélovou matricou. Tým sa zabráni difúzii a 2D vzor je časom stabilný.