Aplikácia markerov mikročastíc na štúdium tráviacej fyziológie Brachionusa
Aplikácia markerov mikročastíc na výskum tráviacej fyziológie Brachionus plicatilis (Rotatoria) INAUGURAL DISSERTATION pre získanie doktorandského titulu na Fakulte matematiky a prírodných vied na Kolínskej univerzite, ktorú predniesla Nicole Anita Lindemann z Duisburg Cologne 2001
Spravodajca: prof. Dr. W. Kleinow prof. Dr. M. Dambach prof. Dr. H. Arndt Deň ústnej skúšky: 11. mája 2001
Obsah 3.2.4 Vplyv faktorov milieu na prechod potravy 96 3.2.4.1 Mikroskopické vyšetrenie hodnoty ph v žalúdku a črevách B. plicatilis 96 3.2.4.2 Vplyv hodnoty ph v médiu 102 3.2.4.3 Porovnanie rýchlostí absorpcie a filtrácie pufrované médiá 105 3.2.5 Vyšetrovanie absorpčných procesov v zažívacom trakte B. plicatilis 116 3.2.5.1 Absorpcia hemoglobínu 116 3.2.5.2 Priama detekcia absorpcie proteínov 121 3.3 Záverečné poznámky a všeobecná diskusia 125 4. Zhrnutie 130 5. Bibliografia 132 Poďakovanie Vysvetlenie pokračovať
Abstrakt Obsah tráviaceho traktu B. plicatilis sa dá rýchlo a ľahko vymeniť zavedením nového typu častíc do média. Bunky kvasiniek sa použili na nahradenie erytrocytov v zažívacom trakte a na preskúmanie schopnosti vírnikov kontrolovať príjem živných častíc. Použitie kvasinkových buniek zafarbených brómtymolovou modrou umožňuje určiť rozdiely v hodnotách ph žalúdka a čreva. Ďalej, v pokusoch s kŕmením sú tieto bunky užitočné na skúmanie rozdielov v sekrécii H + iónov črevom v kultivačnom médiu s odlišnou molaritou. Nakoniec by sa absorpčné procesy mohli demonštrovať nahradením fluorescenčne označených duchov erytrocytov neznačenými duchmi a detekciou dlhotrvajúcej zvyškovej fluorescencie v žalúdočných bunkách. 2
Materiál a metódy 2. Materiál a metódy 2.1 Často používané skratky DTT FITC HEPES LSM MES RSA SDS TRA Tris rpm 1,4-Ditio-DL-Threit (ol) Fluoresceín Izotiokyanát N-2-Hydroxyetylpierazín-N -2-etánsulfónová kyselina Laserové skenovanie -Mikroskop Bovinné sérum albumínu s kyselinou N-morfolín etánsulfónovou dodecylsulfát sodný trietanolamín hydrochlorid tris (hydroxymetyl) aminometán otáčky za minútu 5
Materiál a metódy 2.2 Výrobca chemikálií, látka Stupeň čistoty Appli Chem (Darmstadt) Albumín z hovädzieho séra Citrát (monohydrát kyseliny citrónovej) str. a. DTT MES kvalita tlmivého roztoku hydroxid sodný str. a. Kyselina chlorovodíková p. a. TRA str. a. Boehringer (Mannheim) Tris kryštalický Merck (Darmstadt) roztok brómtymolovej modrej brómfenolovej modrej glutaraldehydu 25% chlorid draselný str. a. Hydrogénfosforečnan draselný str. a. Hydroxid draselný čistý síran horečnatý 7-hydrát str. a. Uhličitan sodný str. a. Chlorid sodný str. a. Dihydrogenfosforečnan sodný 1 hydrát str. a. Hydrogenuhličitan sodný str. a. dihydrát hydrogénfosforečnanu sodného p. a. Zmes morskej soli ditioničitanu sodného Sera (Heinsberg) 6
Materiál a metódy Výrobca, látka Úroveň čistoty Serva (Heidelberg) Chloramfenikol Heparín SDS Sacharóza (sacharóza) výskumná trieda výskumná trieda kryštalická Sigma (Mníchov) FITC HEPES Lytikáza (od Arthrobacter luteus) Merthiolate (Timerosal) Riedel-de-Haën (Hanover) Hydrogenuhličitan amónny tu Chemikálie, ktoré nie sú uvedené, pochádzajú (v kvalite pa) od spoločnosti Merck, Darmstadt. Pokiaľ nie je uvedené inak, boli použité roztoky zmiešané s Aqua bidest. naplánovaný. 7.
Materiál a metódy 2.3 Špeciálne materiály ZNAČKA (Wertheim/Main) Heparinizované mikro hematokritové kapiláry (dĺžka: 75 ± 1,00 mm; vnútorný priemer: 1,15 ± 0,05 mm; vonkajší priemer: 1,55 ± 0,05 mm), Počítacia komora, Neubauer (hĺbka komory: 0,1 mm; počítacia sieť: 9 veľkých štvorcov po 1 mm 2) BRAUN (Melsungen) sterilné krvné lancety, Solofix CORNING COSTAR GmbH (Bodenheim) polyesterová membrána Tanswell-Clear (priemer 24 mm, veľkosť pórov 0,4 µm) PLANO (Wetzlar) Prep-Eze: kôš (typ A) s veľkosťou ôk 75 µm ROTH (Karlsruhe) dialyzačná skúmavka vyrobená z celulózy, Spectra/Por Membrane 3, MWCO: 3 500 dielňa zoologického ústavu (Kolínska univerzita), filtračné zariadenie (Lindemann & Kleinow), 2000), pozri obrázok 1, pozostávajúci z PE rúrky s tesne priliehavou pečiatkou a dvoch uzatvárateľných vývodov. Známka je pokrytá polymónovou gázou (PES 16/5, Schweizer Seidengazefabrik AG Zurich, veľkosť ôk 16 um). Malý filtračný prístroj vyrobený z 5 ml sklenenej injekčnej striekačky FORTUNA OPTIMA (Walter Graf and Co. GmbH & Co., Wertheim) s PE pečiatkou pokrytou gázou (Polymon Gaze PES 16/5, Schweizer Seidengazefabrik AG Zurich, veľkosť ôk 16 um); Výstup injekčnej striekačky je možné uzavrieť lisom na hadicu. 8.
Materiál a metódy 10 cm B A C Obr. 1: Filtračné zariadenie na koncentráciu vírnikov alebo na odstraňovanie malých častíc (erytrocyty, riasy alebo kvasinky) z média obsahujúceho vírniky. Tesne uzavretá pečiatka pokrytá polymónovou gázou (veľkosť ôk 16 µm) B odtok pre premývacie médium C odtok pre koncentrované rotifery bez častíc 9
Materiál a metódy 2.4 Metódy mikroskopického pozorovania 2.4.1 Svetelný mikroskop Použili sa nasledujúce: a) Mikroskop prechádzajúci svetlom Laborlux K (Leitz, Wetzlar, zväčšenie medzi 40 a 1 000). b) Wilovertov reverzný mikroskop s prechádzajúcim svetlom (Will, Wetzlar, zväčšenie medzi 40 a 320). 2.4.2 Fluorescenčný mikroskop Fluorescenčné vyšetrenia sa uskutočňovali na fluorescenčnom mikroskope Orthoplan (Leitz, Wetzlar, zväčšenia 63 - 400) s excitačným filtrom L2 450-490 (rozdeľovač 510, blokovací filter 525/20). Zvieratá sa pozorovali na podložných sklíčkach pod mikroskopickým sklíčkom. 2.4.3 Snímky mikroskopu Snímky svetelného mikroskopu sa snímali zrkadlovou kamerou Minolta X-300 s nasadením objektívu Leitz Periplan (GF 12,5; TL 160 mm 10). Boli použité tieto fólie: Ilford PAN F Plus 50 ASA (čiernobiely negatívny film), Kodak EKTAR 100 ISO 100/21 (farebný negatívny film), Kodak EKTAR 1000-2 (farebný negatívny film), Kodak Royal Gold 100 ISO 100/21 (farebný negatívny film) ), Scotch CHROME 640-T ISO 640/29, 3200 k (farebný diapozitív pre svetlo žiarovky). Na kompenzáciu slabého žltého odtieňa spôsobeného umelým svetlom sa použil modrý filter. 10
Materiál a metódy 1 2 Obr. 2: Usporiadanie na dlhodobejšie pozorovanie jednotlivých zvierat. Zvieratá držané na mieste pomocou sklenenej kapiláry Pyrex () sa v kŕmnom médiu pozorujú pomocou obráteného mikroskopu. Sklenená kapilára je držaná a vedená mikromanipulátorom. Podtlak v zadržiavacej kapiláre sa kontroluje pomocou 2 ml injekčnej striekačky (). 1 = mikromanipulátor, 2 = sklíčko s 1 ml nástavca. 16
Materiály a metódy 2.5.4 Imobilizácia vírnikov ditioničitanom sodným Za účelom mikroskopického vyšetrenia veľkého počtu vírnikov boli zvieratá imobilizované ditioničitanom sodným. 500 μl rotora obsahujúceho médium sa vstreklo do Eppendorfovej reakčnej nádoby s 500 μl ditioničitanu sodného (40 mg/ml). Po ošetrení sa vírniky v úplne vysunutom stave ponoria na dno nádoby. Na stanovenie celkového počtu zvierat a počtu zvierat s naplneným (červeno sfarbeným) tráviacim traktom sa v závislosti od koncentrácie vírnikov pipetovalo 20 - 100 ul z nádoby na duté podložné sklíčko. 2.5.5 Výroba disolučného tlmivého roztoku Výroba von Kleinow a kol. (1991) vyvinuli rozpúšťací pufor nasledovne: V 2 ml destilovanej vody. 0,18 M SDS a 0,03 M hydrogenuhličitanu amónneho sa rozpustilo (pH 8). Pred začiatkom experimentu sa k roztoku pridalo 0,04 g DTT. 17
Materiál a metódy 2.6.4 Duchovia erytrocytov 2.6.4.1 Príprava albumínu FITC (Wißling, 1988 a Johnson & Halborow, 1986) Aby sa zabránilo difúzii fluorescenčného farbiva z duchov, bolo naviazané na proteíny: o 0,5 M viac alkalické Pufr (pH 9,5) sa získal pridaním 5,8 ml 5,3% roztoku Na2C03 k 10 ml 4,2% roztoku NaHC03. 50 mg albumínu sa rozpustilo v 4,5 ml 0,9% roztoku NaCI a pridalo sa 0,5 ml alkalického tlmivého roztoku, po dôkladnom premiešaní sa pridalo 1,5 mg FITC a roztok sa miešal 2 hodiny pri 22 až 25 ° C. Táto zmes sa dialyzovala cez noc proti 4 litrom fyziologického roztoku v dialyzačnom prístroji. Hotový komplex fluorescencie a proteínu sa skladoval na chladnom a tmavom mieste. 2.6.4.2 Roztoky Premývací roztok: hyposmotický pufor: Premývací tlmivý roztok: 0,9% roztok NaCl 5 mm roztok MgS04 160 mm KCl/5 mm HEPES roztok, pH 7,4 Všetky roztoky sa použili na prípravu duchov do približne C chladené. 2.6.4.3 Produkcia vyložených a naložených duchov Čerstvá heparinizovaná krv cicavcov (ovce alebo dobytok) bola centrifugovaná pri 5 000 ot./min. Pri 4 ° C po dobu 10 minút. Po dekantácii plazmatického supernatantu a hornej vrstvy bunkovej kolóny obsahujúcej leukocyty sa Sedi-20
Materiál a metódy 2.6.4.4 Duchovia fixovaní glutaraldehydom Naplnené duchovia boli pripravení a zafixovaní podľa pokynov v častiach 2.6.3 a 2.6.4, pričom k pripraveným a ochladeným duchom bol pridaný roztok glutaraldehydu bez predchádzajúceho premytia. . 22
Materiál a metódy Odber vzoriek filtračného koša Rotifery Erytrocyty Obr. 3: Schematické znázornenie odberu vzoriek: Na fotometrické merania sa vzorka pipetuje z filtračného koša prístupného pre erytrocyty, ale nie pre rotifery. To sa dosiahlo lepením 2 - 3 tkanivových košov (veľkosť ôk 75 um, Plano GmbH Wetzlar). V prvej hodine sa vzorka odoberala každých 5-10 minút, v ďalšom priebehu testu iba každých 20 - 30 minút. Keď sa odobrali vzorky, 2 ml sa pipetovali z filtračného koša do kyvety. Aby sa zaistilo, že suspenzia vo filtračnej vložke zhruba zodpovedá koncentrácii erytrocytov alebo uvoľnenému hemoglobínu v okolitom médiu, bol obsah filtračného koša niekoľkokrát prenesený pomocou pipety do externého média pred odobratím každej vzorky. 24
Materiál a metódy 2.7 Príprava kvasinkových buniek 2.7.1 Výroba kvasinkovej suspenzie 0,5 g pekárskeho droždia (Saccharomyces cerevisiae) sa miešalo v 100 ml morskej vody, kým sa kvasinky rovnomerne nerozdelili. 2.7.2 Príprava fosfátového pufra podľa Sørensena 0,2 M fosfátový pufor s pH 7,0 sa pripravil zmiešaním 30,5 ml 0,2 M roztoku Na2HP04 a 19,5 ml 0,2 M NaH2P04 - Riešenie bolo urobené. Získali sme 0,067 M Sørensen tlmivý roztok zriedením 6,7 dielu tlmivého roztoku 13 dielmi destilovanej vody. (Dawson a kol., 1969). 2.7.3 Príprava tlmivého roztoku fosforečnanu draselného KH2P04 (0,05 M) sa rozpustil v destilovanej vode. pripravené a upravené na pH 7 pomocou KOH. 2.7.4 Farbenie kvasinkových buniek indikátorovým farbivom Namiesto kvasinkových buniek z „Preis Microplan“, ktoré použil Klaus Kühle (1983), sa použili čerstvé pekárske droždie, aby sa mohol vynechať prvý krok centrifugácie. Uskutočnili sa nasledujúce kroky na zafarbenie kvasinkových buniek indikátorovým farbivom: Suspendovanie 250 mg čerstvých pekárskych kvasiniek v skúmavke v 5,0 ml 1/15 M fosfátového pufra (Sørensen), pH 7,0. - Pridanie 25 mg brómtymolovej modrej (rozsah indikátora pH 6,0 - 7,8; zmena farby zo žltej (kyslej) na modrú (zásaditú)) alebo brómu - 26
a b c d Obr. 4a-d: Príjem a prenos erytrocytov v zažívacom trakte B. plicatilis. Typická sekvencia po pridaní erytrocytov v čase 0, pozorovaná na rotiferi, ktorý bol držaný saním na otvorení kapiláry zo skla Pyrex. Pri tomto zväčšení nebolo možné vyfotografovať celé zaostrené zviera. Z dôvodu pohybu zvierat v médiu bolo treba zvoliť krátke expozičné časy s veľkým otvorom. Kalibračná čiara = 100 um. a) Po 10-20 sekundách žalúdok mierne sčervená. b) Po 180 sekundách je žalúdok zreteľne plný a je vidieť prvú farbu čreva. c) Po 15 minútach má žalúdok a črevo intenzívne červenú farbu. d) Po 17 minútach sa obsah čreva vylúči cez konečník. Procesy prechodu nasledujúce po prvom procese sa zvyčajne urýchlili, takže ďalšia evakuácia čriev prebehla už po 10 minútach. U všetkých použitých cicavčích erytrocytov (ľudí, hovädzieho dobytka a oviec) boli vo výkaloch viditeľné iba fragmenty membrány a červený farebný oblak pozostávajúci z uvoľneného hemoglobínu, ktorý sa v médiu rýchlo rozptýlil. V jednotlivých prípadoch, ktoré sú stále viditeľné počas prvého vyprázdňovania, 30
Ak by sa také problémy dali vyriešiť, bolo by pre ďalšie výskumy mysliteľné použitie duchov, ktoré boli naplnené substrátmi fluorogénnych enzýmov. Túto metódu by bolo možné použiť napr. Lokalizujte enzýmy v zažívacom trakte. a b Obr. 5a-b: Jasné pole a fluorescenčná fotografia rotora 5 minút po kŕmení duchmi, ktorí boli naplnení FITC-označeným albumínom (kalibračná čiara = 50 um). 50 ul suspenzie s duchmi albumínu FITC sa pridalo k 500 ul média obsahujúceho vírniky. Po päťminútovom zachytávaní častíc sa vírniky zbavili voľných fluorescenčných duchov niekoľkonásobným prepláchnutím cez 16 μm nylonový filter a vzorka zvieraťa sa preniesla na podložné sklíčko. a) Fluorescenčný obraz, b) Na lokalizáciu fluorescencie v zažívacom trakte sa obraz a prevrátil a umiestnil nad obraz toho istého zvieraťa v jasnom poli. 33