Baktericídny účinok sekundárnej rastlinnej látky izotiokyanát - GRIN
Technické práce (škola), 2012
36 strán, známka: 1,0
Johannes Rößler (autor)
Obsah
2. Teoretické základy
2.1 Prirodzený výskyt glukozidov
2.2 Dôležitosť izotiokyanátu pre rastlinu
2.3 Chemické princípy
2.3.1 Glukozidy
2.3.2 Sinigrín
2.3.3 Izotiokyanát
2.4 Enzymatická premena
2.5 Cieľ seminárnej práce
3. Experimentálna implementácia a vysvetlenie
3.1 Použité skúšobné pokyny
3.2 Extrakcie
3.2.1 Extrakcia sinigrínu
3.2.2 Extrakcia myrozinázy
3.3 Enzymatická hydrolýza glukozidového extraktu na izotiokyanát
3,4 tenkovrstvová chromatografia
3.4.1 Vysvetlenie metódy tenkovrstvovej chromatografie
3.4.2 Vykonanie chromatografie na tenkej vrstve sinigrínu
3.4.3 Vykonanie tenkovrstvovej chromatografie na izotiokyanáte
3.4.4 Vykonanie tenkovrstvovej chromatografie na izotiokyanáte a sinigríne
3,5 enzýmový test
3.5.1 Vykonanie enzýmového testu
3.5.2 Vykonanie tenkovrstvovej chromatografie enzýmového testu
3.5.3 Vysvetlenie enzýmového testu
3.6 Antibakteriálne detekčné metódy
3.6.1 Inhibičný test na preukázanie antibakteriálneho účinku izotiokyanátu
3.6.2 Bioautografia
4. Výsledky
4.1 Výsledky tenkovrstvovej chromatografie
4.1.1 Výsledky tenkovrstvovej chromatografie na Sinigríne
4.1.2 Výsledky tenkovrstvovej chromatografie izotiokyanátu
4.1.3 Výsledky tenkovrstvovej chromatografie izotiokyanátu a sinigrínu
4.1.4 Výsledky tenkovrstvovej chromatografie z enzýmového testu
4.1.5 Hodnoty Rf, ktoré predstavujú relatívnu jazdnú vzdialenosť v DC
4.2 Výsledky antibakteriálnych detekčných metód
4.2.1 Výsledok inhibičného testu
4.2.2 Výsledok bioautografie
7. Príloha
7.1 Zoznam skratiek
7.2 Tabuľky
1. Úvod
2. Teoretické základy
2.1 Prirodzený výskyt glukozidov
Glukozidy sa tvoria z aminokyselín v sekundárnom metabolizme rastlín (Watzl, 2001). Aminokyseliny sa štiepia na aldoxím, ktorý sa dekarboxyluje na kyselinu fenyloctovú a potom na glukozid (Kindl, 1975). Glukozidy sa prirodzene vyskytujú iba v rastlinách vyššieho rodu (Dörnemann, 2008), napríklad v čeľadi brukvovité (Brassicaceae, synonymum. Cruciferae; Ahlheim, 1983) ako najdôležitejší predstaviteľ rodu (Luciano, 2009). Glukozidy sa však dajú nájsť aj v kaparoch (Capparidaceae), nasturtiach (Tropaeolaceae) a rastlinách Reseda (Rescedaceae) (Dörnemann, 2008). V súčasnosti je známych celkovo asi 130 rôznych glukozidov (Wittstock, 2004). Obsah sušiny v glukozidoch môže byť u niektorých druhov rodu Brassica až 1% (Watzl, 2001), ale množstvo glukozidov v divokej forme môže 1000-krát prekročiť množstvo obsiahnuté v kultivovanej rastline (Watzl, 2001).
Glukozidy horčičného oleja sa nachádzajú v rastlinách horčice (Sinapis), ktoré tiež patria do čeľade krížovcovitých (Ahlheim, 1983; Dörnemann, 2008). Rôzne druhy horčice však tvoria zmes rôznych glukozidov horčičného oleja (Lara-Lledó, 2012). Biela horčica (Sinapis alba) produkuje hlavne sinapín, zatiaľ čo čierna horčica (Brassica nigra) a horčica orientálna (Brassica juncea) produkujú hlavne sinigrín (Lara-Lledó, 2012). Všeobecne vzhľad štipľavého zápachu po zničení bunkového tkaniva rastliny môže naznačovať prítomnosť glukozidov horčičného oleja (Dörnemann, 2008). Tento štipľavý zápach spôsobujú horčičné oleje (izotiokyanáty), vznikajú enzymatickým rozkladom glukozidu horčičného oleja.
Enzým, ktorý hydrolyzuje glukozid z horčicového oleja, sa nazýva myrozináza alebo β-tioglukozidáza (Lara-Lledó, 2012; Luciano, 2009; Watzl, 2001; Dörnemann, 2008). Vyskytuje sa vo všetkých rastlinách, ktoré produkujú horčičné oleje.
2.2 Dôležitosť izotiokyanátu pre rastlinu
Produkty enzymatického rozkladu glukozidov horčičného oleja poskytujú rastline vysoko účinné obranné látky proti predátorom (bylinožravcom) a rastlinným patogénnym mikroorganizmom (Wittstock, 2004; Aires, 2009). Tieto produkty sú rôzne izotiokyanáty (ITC), tiokyanáty a nitrily, ktoré vykazujú enormnú toxicitu voči mikrobiologickým organizmom (Lara-Lledó, 2012; Watzl, 2001; Wittstock, 2004; Luciano, 2009). Samotný izotiokyanát má baktericídny, fungicídny, herbicídny a toxický účinok na živočíšne tkanivo (Aires, 2009; Luciano, 2009; Lara-Lledó, 2012; Hock, 1984).
Táto forma sebaochrany rastlín je známa ako konštitutívna obrana, pretože v bunke sa pred kontaktom s bylinožravcami alebo patogénom vytvorilo predbežné štádium obranného prostriedku. Rastlinný toxín sa však produkuje iba vtedy, keď je bunková štruktúra priamo zranená. Tento proces sa často nazýva „bomba“ z rastlinného horčičného oleja, pretože sa „spúšťa“ iba pri priamom kontakte týchto dvoch zložiek (Wittstock, 2004).
V rastline horčice alebo horčičnom semienku sú priestorovo oddelené glukozid horčičného oleja a myrozináza. Enzýmový substrát (glukozid z horčičného oleja) je umiestnený v kompartmentoch (vakuolách) blízko bunkovej steny (Rausch, 1999), zatiaľ čo enzým (myrozináza) je distribuovaný v takzvaných indoblastoch (špecializované bunky/„čudáci“ bunkovej štruktúry) (Sitte, 1998) . Enzým a jeho substrát prichádzajú do styku mechanickým pôsobením, po ktorom začne reakcia a obranný toxín rozvinie svoj účinok (Dörnemann, 2008; Lara-Lledó, 2012; Watzl, 2001). Avšak iné rastlinné rody, ktoré obsahujú glukozidy, ukladajú substrát a enzým rôznymi spôsobmi. Žerucha obyčajná (Arabidopsis thaliana) napríklad vytvára takzvané S bunky obsahujúce glukozid v blízkosti sita, ako aj vlastné bunky myrozinázy na kôre (Wittstock, 2004).
2.3 Chemické princípy
2.3.1 Glukozidy
Glukozidy (glukozinoláty) (obrázok 1) sú chemicky stabilné, neprchavé iónové biomolekuly, ktoré patria do skupiny metabolitov obsahujúcich síru. Pozostávajú z glukózovej jednotky na skupine obsahujúcej síru a dusík, sulfátovej skupiny a variabilného zvyšku. Štruktúra je teda kombináciou tioglukózového zvyšku na N-hydroxyiminosulfátovom estere a aglukónového zvyšku (R, pozri nižšie). Tento radikál môže pozostávať z alkylovej, alkenylovej, arylovej alebo indolylovej skupiny. Určuje fyziologický účinok (Watzl, 2001; Wittstock, 2004). Na sulfátovej skupine je katión, zvyčajne K + (Dörnemann, 2008).
Obrázok nie je súčasťou tohto výňatku
Obrázok 1: Všeobecná štruktúra glukozidu horčičného oleja
Nomenklatúra glukozidov je odlišná, takže keď sa vytvorí bežný názov, pred názvom rastliny sa uvádza „Gluco“ a dopĺňa sa koniec „in“. Napríklad glukozid potočnice lekárskej (Nasturtium officinale) sa označuje ako „Gluco-nasturti-in“ (Dörnemann, 2008). Systematický názov je však presnejší, ako ukazuje obrázok 2.
Obrázok nie je súčasťou tohto výňatku
Obrázok 2: Príklad názvoslovia žeruchy
2.3.2 Sinigrín
Systematický názov sinigrínu je alylglukozinolát, chemická látka je 1- (N- (sulfoxy))-
3-butenimidát-1 -tio-p-D-glukopyranóza. Empirický vzorec je:
[C10H16NO9S2] -K +. Molekulová hmotnosť je 397,46 g/mol (Sigma-Aldrich). Obrázok 3 zobrazuje štruktúru sinigrínu.
Obrázok 3: Molekulárna štruktúra sinigrínu
Obrázok nie je súčasťou tohto výňatku
2.3.3 Izotiokyanát
Izotiokyanáty sú zhrnuté pod pojmom „horčičné oleje“. Izotiokyanáty sú prchavé a chemicky nestabilné molekuly, ak sú tvorené z indoylglukozinolátov. Spontánne sa rozkladajú na indol-3-karbinol a ďalšie indolové zlúčeniny (Watzl, 2001). Vznikajú enzymatickým rozkladom glukozidu horčičného oleja a majú toxický účinok. Základná štruktúra je nasledovná (obrázok 4):
Obrázok nie je súčasťou tohto výňatku
Obrázok 4: Všeobecná molekulárna štruktúra ITC
Pri premene alylglukozinolátu vzniká allylizotiokyanát (AITC) (Aires, 2009). Empirický vzorec pre toto je C4H5NS (štruktúrny vzorec pozri obrázok 5). Molekulová hmotnosť je 99,15 g/mol (Sigma-Aldrich).
Obrázok nie je súčasťou tohto výňatku
Obrázok 5: Molekulárna štruktúra AITC
2.4 Enzymatická premena
Hydrolýza glukozidu horčičného oleja na horčicový olej je katalyzovaná myrozinázou, čím je hydrolyzovaná väzba síra-glukóza substrátu (glukozid horčičného oleja) (Wittstock, 2004). Vznikajú ekvimolárne množstvá p-D-glukózy, síranu a glukozidovo špecifického aglukónu. Kyselina askorbová tu pôsobí ako koenzým, pretože môže poskytovať nukleofilnú katalytickú skupinu. Nestabilný aglukón ďalej reaguje na primárny produkt, izotiokyanát, v závislosti od hodnoty pH a teploty (Wittstock, 2004). Taktiež sa tvoria sekundárne produkty ako tiokyanáty, nitrily a epitionitrily (Lara-Lledó, 2012). Izotiokyanáty sa tvoria hlavne pri neutrálnej hodnote pH, zatiaľ čo nitrily sa tvoria pri kyslej hodnote pH (Wittstock, 2004). Obrázok 6 zobrazuje prehľad procesu enzymatickej premeny.
Obrázok nie je súčasťou tohto výňatku
Obrázok 6: Mechanizmus a produkty enzymatickej premeny glukozidov
2.5 Cieľ seminárnej práce
Cieľom tejto práce je extrahovať horčicový olej glukozid sinigrín a enzým myrozináza zo semien horčice. Enzým by mal hydrolyzovať glukozid na izotiokyanát (ITC). Ďalej by sa mal potvrdiť antibakteriálny účinok produktu enzymatickej reakcie a v zmesi látok reakcie by sa mal identifikovať ITC.
Cieľom tejto práce bolo po prvýkrát zistiť, či je zjednodušená verzia bioautografickej metódy (Reusser, 1967) vhodná na separáciu izotiokyanátu z reakčnej zmesi extrakčného procesu (chromatografia na tenkej vrstve) a jeho identifikáciu kvôli jeho toxickému účinku na baktérie.
Pokusy sa uskutočňovali so semenami Brassica juncea, pretože podľa informácií spoločnosti Develey GmbH obsahujú viac glukozidu horčičného oleja ako semená Sinapis alba opísané v pokynoch k pokusu (Dörnemann, 2008).
3. Experimentálna implementácia a vysvetlenie
3.1 Použité skúšobné pokyny
Pokyny na test na extrakciu myrozinázy a sinigrínu, protokol na enzymatickú konverziu a implementáciu tenkovrstvovej chromatografie (TLC), sú z väčšej časti pokynmi pre kurz: „Sekundárne rastlinné zložky“ od PD Dr. Dieter Dörnemann, Philipps-Universität Marburg na katedre biológie (fyziológia rastlín/fotobiológia) prijatý (Dörnemann, 2008).
Jednotlivé čiastkové postupy sa však zmenili nezávisle. Horčica odrody Brassica juncea sa používala na extrakciu sinigrínu a myrozinázy, pretože táto odroda má najvyšší obsah sinigrínu, a preto podľa literatúry vykazuje najsilnejší antibakteriálny účinok (Lara-Lledó, 2012).
Pokyny pre test bakteriálnej inhibície boli prevzaté z knihy „Mikrobiologisches Praktikum“ (Drews, 1983). Metóda bioautografie bola upravená z: „Metóda bioautografie tenkovrstvových chromatogramov“ (Reusser, 1967).
3.2 Extrakcie
3.2.1 Extrakcia sinigrínu
Proces čistenia sinigrínu sa začal mletím 10 g horčičných semien v mažiari s pridaním 30 ml 80% vodného etanolu. To zničilo štruktúru buniek a uvoľnilo glukozid. Alkohol zabránil enzymatickej premene sinigrínu myrozinázou. Homogénna hmota sa potom preniesla do nádoby s jedným hrdlom a doplnila sa na 100 ml 80% etanolom (vodný). Produkt sa potom varil 60 minút pomocou spätného chladiča (obrázok 7), zahrieval sa na vodnom kúpeli a teplota varu bola približne 85 ° C v dôsledku zmesi etanolu a vody.
Obrázok nie je súčasťou tohto výňatku
Obrázok 7: Extrakcia sinigrínu na obrázku 8: Banka
Vodný kúpeľ s refluxným kondenzátorom 1. Extrakcia sinigrínom
Výsledkom bolo, že sa sinigrín naviazal na zmes etanolu a vody. Výsledný vodný etanolový supernatant bol potom odstránený (1. extrakcia, obrázok 8). Použitím tejto metódy sa zvyšok opäť zmiešal s 50 ml 80% vodného etanolu. Tentokrát sa varil iba 30 minút pomocou spätného chladiča. Táto druhá extrakcia by mala zvýšiť výťažok sinigrínu. Supernatanty z dvoch extrakcií sa spojili a centrifugovali, aby sa úplne oddelili pevné látky, a supernatant sa znova odstránil na ďalšie spracovanie. V rotačnej odparke (obrázky 9 a 10) sa potom všetok etanol odstráni vo vákuu a sinigrín sa koncentruje vo vodnej fáze (obrázok 11).
Obrázok nie je súčasťou tohto výňatku
Obrázok 10: Pred koncentráciou
Obrázok nie je súčasťou tohto výňatku
Obrázok 9: Rotačný odparovač Obrázok 11: Po zahustení
Potom sa zmes najskôr doplní na 10 ml vodou (dd.) So silnou bielo-žltkastou zrazeninou. Potom sa doplní na 30 ml vodou (dd.). Potom sa niekoľkokrát extrahovala dietyléterom, v dôsledku čoho hydrofóbne zložky (napríklad bunkové lipidy) prešli do éterovej fázy a z extraktu sa odstránili oddelením a opätovným použitím spodnej fázy. Vyššie uvedená biela zrazenina sa mohla odstrániť éterovou extrakciou. Vodná fáza obsahujúca sinigrín sa potom skoncentrovala na 5 ml na rotačnej odparke, aby sa sinigrín zahustil. Vedľajším účinkom odparenia je úplné odstránenie zvyšného dietyléteru. Získaný prípravok sa rozdelil na alikvóty 4 x 200 μl a zmrazil sa na -20 ° C alebo sa podrobil tenkovrstvovej chromatografii a enzymatickej premene.
3.2.2 Extrakcia myrozinázy
Aby sa inhibovali bunkové proteázy, ktoré by mohli štiepiť enzým, ktorý sa má extrahovať myrozináza, všetky purifikačné kroky sa uskutočňovali ochladeným spôsobom, takže malta, tĺčik a príbory sa pred experimentom ochladili pomocou N2 (kvapalný). Teraz bolo rozomletých 20 g semien horčice (obrázok 12), čím sa z buniek uvoľnil enzým.
Obrázok nie je súčasťou tohto výňatku
Obrázok 12: Zahĺbenie Obrázok 13: Dekantovanie Obrázok 14: Dialýza
3.3 Enzymatická hydrolýza glukozidového extraktu na izotiokyanát
Názov Baktericídny účinok sekundárnej rastlinnej látky izotiokyanát (horčicový olej) Stupeň 1.0 Autor Johannes Rößler (Autor) Rok 2012 Rozsah 36 Katalógové číslo V300661 ISBN (elektronická kniha) 9783656966845 ISBN (kniha) 9783656966852 Veľkosť súboru 1824 KB Jazyk Nemecký jazyk Poznámky 1. cena 10. konferencie študentov technických odborov Univerzita v Mníchove, spolupráca s Helmholtzovým centrom v Mníchove, podporovaná spoločnosťou Develey GmbH. Kľúčové slová Gymnasium Grafing, Technická univerzita v Mníchove, Helmholtz Zentrum München, študentská konferencia TUM, horčica, horčičný olej, glukozid, izotiokyanát, bioautografia, myrozináza, baktericídny účinok, Sinapis juncea, tenkovrstvová chromatografia, test bakteriálnej inhibície, chémia, biochémia, seminárna práca Cena (kniha) 14,99 € (eBook) 12,99 € dielo citujúce Johannesa Rößlera (autor), 2012, baktericídny účinok sekundárnej rastlinnej látky izotiokyanát (horčicový olej), Mníchov, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/300661
- Zatiaľ žiadne komentáre.