Čistenie bielkovín - biológia
Čistenie bielkovín (tiež Čistenie bielkovín) opisuje proces obohacovania a čistenia jedného alebo viacerých proteínov z komplexnej biologickej zmesi alebo roztoku obsahujúceho niekoľko biomolekúl. Toto obohatenie sa môže uskutočniť v niekoľkých po sebe nasledujúcich krokoch čistenia pomocou rôznych metód čistenia, ktorých účinnosť (zmysluplná postupnosť) a ich účinnosť (stupeň čistenia) sa sledujú a kvantifikujú analytickými metódami.
Princípy separácie
Na oddelenie proteínov sa využijú výhody ich rôznych charakteristík vďaka postupnosti a špecifickej štruktúre. Pri iónomeničovej chromatografii a izoelektrickej fokusácii je to izoelektrický bod, v SDS-PAGE molekulová hmotnosť a posttranslačné modifikácie, vo vylučovacej chromatografii a centrifugácii molekulová hmotnosť a konformácia. Izopyniková centrifugácia sa oddeľuje na základe hustoty. Afinitná chromatografia využíva rozdiely v afinite pre selektívny ligand alebo v príslušných disociačných konštantách. Hydrofóbne látky, reverzná fáza a polárna chromatografia sa oddeľujú podľa polarity rôznych exponovaných polárnych aminokyselín a posttranslačných modifikácií. Zrážanie kozmotropickými soľami [1] zo série Hofmeister, vodorozpustnými organickými rozpúšťadlami alebo teplota sú založené na zmenených rozpustnostiach. Extrakcia extrakčným činidlom (zvyčajne inou fázou) alebo polyetylénglykolom [1] je založená na polarite a rôznych rozpustnostiach v rozpúšťadle alebo v detergente, ako je napr. B. Zmesi fenolu, chloroformu a izoamylalkoholu (tiež s chaotropmi, ako je guanidíniumtiokyanát [2]) alebo s fázovou separáciou jedného percenta (m/V) roztokov Triton X-114 pri 4 ° C [3] [4] [5] [6]
Spravidla sa niekoľko metód uskutočňuje v sériách, výber metódy závisí od vlastností proteínu, od príslušných interferenčných sprievodných látok závislých od metódy pre následné postupy a od akejkoľvek súvisiacej denaturácie. Vyššie stupne čistenia (alebo čistiace faktory) procesu umožňujú menší počet čistiacich krokov, napr. B. s tandemovým afinitným čistením.
Pretože proteíny, ktoré sa majú čistiť, väčšinou rekombinantné proteíny, sú ohrozené inaktiváciou, denaturáciou alebo proteolýzou počas bunkového narušenia, čistenie proteínov sa často vykonáva rýchlo pri teplote 4 ° C v prítomnosti proteázových inhibítorov. Niektoré proteázové inhibítory sa používajú iba vtedy, ak nie je narušená funkcia proteínu, ktorý sa má čistiť, alebo je jeho funkcia zanedbateľná, pretože môžu modifikovať proteín pomocou kovalentnej väzby.
Proces separácie
Chromatografia
- Iónomeničová chromatografia (IEX)
- Vylučovacia chromatografia (SEC)
- Afinitná chromatografia
- polárna chromatografia
- Chromatografia na základe hydrofóbnej interakcie (HIC) a chromatografie na reverznej fáze (RPC)
Elektroforéza
Ťažba a zrážanie
- sériové extrakcie
- sériové zrážky
Filtrácia
- dialýza
- Tangenciálna filtrácia
- Mikrofiltrácia
sedimentácia
- Odstreďovanie
- Pulldown testy
- pomocou protilátok: MACS, perličkové testy a imunoprecipitácia
Odparovanie
Postup overovania
Po jednotlivých fázach purifikácie proteínov sú purifikované proteíny charakterizované a kvantifikované. Účinnosť celého čistenia je určená rovnováhou so stupňom čistenia (ako prevrátená hodnota hmotnostného zlomku) z bielkovinovej hmoty, alebo - v prípade enzýmov - tiež je možné určiť stupeň čistenia z enzýmových aktivít, napr. B. kvocient celkovej hmotnosti purifikovaného proteínu a počiatočnej hmotnosti príslušného proteínu vo východiskovej látke alebo analogický kvocient vytvorený s aktivitami.