Dynamika a agregácia katalyzovaných proteínov reguluje funkcie proteínov Max Planck Society
Biokatalýza
Obr. 1: Neaktívna cysteínproteáza AvrRpt2 z Pseudomonas syringae je aktivovaná peptidyl-prolyl-cis/trans-izomerázou ROC1 z Arabidopsis thaliana. Oba proteíny tvoria Michaelisove komplexy, v ktorých je AvrRpt2 substrátom pre ROC1 a v ktorých katalytický proces vedie k zvýšeniu rýchlosti reverzibilnej cis/trans izomerizácie kritickej prolylpeptidovej väzby.
Vedci vedení Gunterom Fischerom identifikovali proteolytickú reakciu, pri ktorej by malo byť možné porovnať zvýšenie dynamiky reťazca neaktívnej proteázy s aktiváciou proteázovej funkcie v prítomnosti peptidovej väzby-cis/trans-Korelátová izomeráza. Táto reakcia slúži ako signálna dráha pre imunitnú reakciu rastliny na napadnutie baktériou Pseudomonas syringae známe. Neaktívna cysteínproteáza AvrRpt2 sa prenáša do rastliny, steny žeruchy, prostredníctvom systému vylučovania baktérií typu III Arabidopsis thaliana, prepašovaný dovnútra. ROC1, prototypový peptidyl-prolyl-cis/trans-Izomeráza v Arabidopsis, potom aktivuje proteolytickú funkciu AvrRpt2 takým spôsobom, že niektoré proteíny rezistencie môžu teraz nadobudnúť účinnosť (Obr).
Obr. 2: Aktivácia proteázovej funkcie neaktívnej cysteínovej proteázy AvrRpt2 z Pseudomonas syringae sa dosahuje pomocou ROC1, prototypu cyklofilínu z Arabidopsis thaliana. Ako ukazujú profily HPLC reakčných zmesí, fragment AvrRpt272-255 (1,0 uM) môže rozbiť peptidovú väzbu Gly-Gly vo fluórogénnom oligopeptide Abz-IEAPAFGGWy-NH2 (y = 3-nitrotyrozín) aj počas veľmi dlhej inkubácie (255 hodín) pri teplote miestnosti nerozdeľujte (C). Samotný ROC1 (10 uM) je tiež neaktívny (B). Ak sú však oba proteíny zmiešané s oligopeptidom v inkubačnej dávke, je takmer po uplynutí niekoľkých sekúnd (vrchol v 23,3 min) (A) viditeľná takmer úplná spotreba substrátu. Dva produkty štiepenia Abz-IEAPAFG-OH (vrchol pri retenčnom čase 17,2 minúty; MW 822,9 g/mol; m/z 823,2) a H-GWy-NH2 (vrchol pri retenčnom čase 15,2 minúty, MW 468,4 g/mol; m/z 469,1) sú výsledkom katalyzovanej hydrolýzy väzby Gly-Gly. Je tiež zobrazený vrchol CypA.
Tieto výskumy po prvýkrát dokazujú, že lokálne zvýšenie dynamiky hlavného reťazca môže spôsobiť, že proteín uvoľní predtým skrytú schopnosť, v tomto prípade proteolýzu substrátu. Zároveň je zrejmé, že tento mechanizmus hrá úlohu nielen v skúmavke, ale aj v živej bunke, napr. B. v imunitnej odpovedi rastlín na bakteriálne infekcie. Vedci sú v súčasnosti v procese identifikácie prolínu zodpovedného za aktiváciu AvrRpt2 v jeho aminokyselinovej sekvencii a získavania vyjadrení o štruktúre a dynamike príslušných komplexov Michaelis prostredníctvom štúdií NMR (zamestnanci: Cordelia Schiene-Fischer, Christian Lücke, Günther Jahreis).
Alzheimerova choroba
Alzheimerova choroba je najčastejšou príčinou demencie v Nemecku. Toto ochorenie je pravdepodobne založené na tvorbe vláknitých bielkovinových usadenín - takzvaných amyloidových vlákien. Pri Alzheimerovej chorobe sú tieto vlákna tvorené peptidom Ap. Je však pravdepodobné, že fibrily nie sú rozhodujúcim spúšťačom ochorenia, ale skôr ich štrukturálnymi prekurzormi, ktoré sa vyskytujú ako medzistupne v procese formovania. Medzitým bolo možné izolovať niekoľko z týchto medzistupňových etáp a skúmať ich biochemicky. Na elektrónových mikrofotografiách možno vidieť malé sférické štruktúry, takzvané oligoméry, ako aj väčšie vláknité stavy, ktoré sú známe ako protofibrily (Obr). Okrem ich morfologického tvaru však presnejšia molekulárna štruktúra týchto medziproduktov zostávala dlho skrytá. Spolu s pracovnými skupinami v Magdeburgu, Lipsku a Jene sa Marcusovi Fändrichovi teraz podarilo získať podrobné informácie o štruktúre týchto oligomérnych a protofibrilárnych medziproduktov.
Snímky amyloidových fibríl vľavo (vľavo) a rôznych montážnych medziproduktov, ako sú protofibrily (v strede) a oligoméry (vpravo) v elektrónovom mikroskope. Lišta mierky zodpovedá 200 nm.
Práce na štruktúre protofibrilárnych a oligomérnych medziproduktov umožnila skutočnosť, že rôzne medzistupne bolo možné stabilizovať pomocou vhodných postupov dostatočne dlho, a tak sa stať prístupnými pre biofyzikálne výskumné metódy. V prípade protofibrilárnych medzistupňov sa to dosiahlo skorším náhodným nálezom. Pracovná skupina zistila, že fragment protilátky, ktorý izoloval, je schopný zasiahnuť v konkrétnom kroku procesu montáže a zabrániť premene protofibrilárnych medziproduktov na amyloidové fibrily. Týmto spôsobom mohli byť Ap protofibrily podrobené hlbšiemu štrukturálnemu výskumu pomocou takzvanej spektroskopie nukleárnej magnetickej rezonancie v pevnom stave. Táto spektroskopická metóda umožňuje pozorovať jednotlivé atómy v molekule a ich chemické prostredie.
Fändrich a jeho tím zistili, ktoré štrukturálne prvky stabilizujú medzistupne montáže a v čom sa líšia navzájom od dospelých amyloidových fibríl v rôznych medzistupňoch. Zistilo sa, že medziprodukty - podobne ako amyloidové fibrily - majú štruktúru p-listu, ale je usporiadaná odlišne v porovnaní s neskoršími stupňami zostavovania. Identifikácia stabilizačných prvkov v amyloidových medziproduktoch je rozhodujúcim predpokladom pre vývoj cielených inhibítorov, ktoré zabraňujú tvorbe takýchto štruktúr. V rámci svojej prebiehajúcej práce skupina preto vyvíja peptidové metódy intervencie v mechanizme tvorby neurotoxických proteínových štruktúr. Prvé výsledky sú sľubné a naznačujú účinok neutralizujúci toxicitu. Z dlhodobého hľadiska sa predpokladá, že bude schopný odvodiť nové body útoku alebo cieľové štruktúry pre vývoj terapie.
Chaperóny PDI a klientske proteíny
ERp46 sa líši od ERp29 v tom, že môže vykonávať katalytickú funkciu pri redoxných reakciách. Pri rôznych koncentráciách glukózy je rozdielne exprimovaný v ß-bunkách Langerhansových ostrovčekov v tkanive pankreasu a môže tiež slúžiť na kontrolu adiponektínových signálov. Rozdiel vo väzbových vlastnostiach pre ERp29 a ERp49 je zrejmý vo vyššie uvedených peptidových knižniciach. Z toho sa odvodilo, že ERp46 môže interagovať s ERp29 v dvoch rôznych bodoch. Pre lepšie pochopenie týchto interakcií molekulárne bola vykryštalizovaná tretia doména ERp46 (doména a´). V tejto súvislosti je zaujímavé, že u myší s deficitom ERp29 je ERp46 upregulovaný a súčasne sú ovplyvnené aj proteíny, ktoré riadia metabolizmus mastných kyselín. Na testovanie týchto vzťahov boli vyradené myši ERp29 podrobené diéte s vysokým obsahom tukov a boli analyzované na schopnosť absorbovať glukózu z krvi (Obr. 4d). Zatiaľ čo myši divokého typu vykazovali významne znížený profil absorpcie, ktorý je charakteristický pre intoleranciu glukózy pri cukrovke, významne zlepšený profil sa našiel u knock-out myší ERp29 (P.